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如何操作賽默飛熒光定量PCR儀

2025-3-24　　閱讀(242)

操作賽默飛熒光定量PCR儀需要按照一系列步驟來(lái)配置設(shè)備、設(shè)置實(shí)驗(yàn)程序、運(yùn)行實(shí)驗(yàn)和分析數(shù)據(jù)。以下是詳細(xì)的操作步驟和注意事項(xiàng)，幫助您順利完成實(shí)驗(yàn)。

一、準(zhǔn)備工作

在正式操作賽默飛熒光定量PCR儀前，請(qǐng)確保以下準(zhǔn)備工作已完成：

檢查儀器狀態(tài)：

確保儀器已連接電源并啟動(dòng)。
檢查熱蓋和樣品架，確保它們安裝牢固并處于正常工作狀態(tài)。

檢查反應(yīng)體系：

準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系，包括模板、引物、酶、熒光染料等。
準(zhǔn)備好所需的樣品（如DNA、RNA模板），并檢查其濃度。

確保計(jì)算機(jī)和儀器連接正常：

確保儀器與控制計(jì)算機(jī)或觸摸屏之間的連接正常，可以順利打開(kāi)實(shí)驗(yàn)軟件。

二、創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)程序

打開(kāi)儀器：

按下設(shè)備的開(kāi)機(jī)按鈕，啟動(dòng)儀器。儀器啟動(dòng)后，屏幕會(huì)顯示歡迎界面。
如果儀器已配備觸摸屏界面，直接通過(guò)觸摸屏操作。

進(jìn)入實(shí)驗(yàn)設(shè)置界面：

在儀器軟件的主界面上，選擇“新建實(shí)驗(yàn)"或“新建程序"選項(xiàng)，以創(chuàng)建新的實(shí)驗(yàn)程序。

輸入實(shí)驗(yàn)信息：

在創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需要輸入實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)描述、樣本信息（如目標(biāo)基因、引物等）等相關(guān)信息。
選擇PCR類(lèi)型：通常選擇“熒光定量PCR"。
選擇引物類(lèi)型：如果使用SYBR Green、TaqMan或其他探針，進(jìn)行相應(yīng)選擇。

設(shè)置反應(yīng)體系：

反應(yīng)體積：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置反應(yīng)體積（常見(jiàn)體積有20 μL、25 μL、50 μL等）。
樣品信息：輸入樣品類(lèi)型和濃度信息。確保樣品濃度與反應(yīng)體系相匹配。
引物/探針選擇：輸入或選擇所使用的引物和探針信息。確保熒光探針的選擇正確，并且與所用的熒光染料兼容。

三、設(shè)置熱循環(huán)條件

設(shè)置溫度和時(shí)間：

變性溫度：通常設(shè)置在94-98°C之間。
退火溫度：根據(jù)引物的Tm值，通常設(shè)置在50-65°C之間。
擴(kuò)增溫度：一般設(shè)置為72°C（適用于大多數(shù)DNA聚合酶）。
延伸時(shí)間：根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度設(shè)定，通常設(shè)置為每千堿基15秒。

設(shè)置循環(huán)次數(shù)：

設(shè)置PCR循環(huán)次數(shù)，通常為40次，但根據(jù)樣品特性可以適當(dāng)調(diào)整。

熔解曲線分析（可選）：

如果需要進(jìn)行特異性檢測(cè)，可以在最后一步啟用熔解曲線分析。熔解曲線可以幫助檢測(cè)PCR產(chǎn)物的特異性，避免非特異性擴(kuò)增。

四、選擇熒光檢測(cè)通道

選擇適當(dāng)?shù)臒晒馊玖?/strong>：

如果使用單一染料（如SYBR Green），選擇對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道。
如果使用多種熒光染料（如TaqMan探針），選擇多個(gè)通道進(jìn)行多重檢測(cè)。

設(shè)置熒光信號(hào)采集時(shí)間點(diǎn)：

在每個(gè)擴(kuò)增周期的合適位置采集熒光信號(hào)。通常選擇在擴(kuò)增的末期進(jìn)行熒光信號(hào)采集。

五、啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)

檢查所有設(shè)置：

在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，確保所有設(shè)置無(wú)誤，檢查反應(yīng)體系、溫度條件、循環(huán)次數(shù)和熒光探針設(shè)置等。
如果一切正常，點(diǎn)擊“開(kāi)始實(shí)驗(yàn)"按鈕啟動(dòng)PCR反應(yīng)。

儀器運(yùn)行：

儀器會(huì)自動(dòng)完成熱循環(huán)過(guò)程，同時(shí)通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)反應(yīng)中的熒光信號(hào)變化。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程可以實(shí)時(shí)查看圖表、溫度、熒光信號(hào)等數(shù)據(jù)。

六、數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)完成后查看數(shù)據(jù)：

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，儀器會(huì)生成實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，包括Ct值、熒光信號(hào)變化曲線等。
點(diǎn)擊“數(shù)據(jù)分析"進(jìn)入數(shù)據(jù)分析界面，可以選擇查看熒光信號(hào)曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、Ct值等。

數(shù)據(jù)分析選項(xiàng)：

Ct值分析：根據(jù)熒光信號(hào)的變化，自動(dòng)計(jì)算各樣本的Ct值，并進(jìn)行基因定量。
標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：如果需要定量分析樣本的濃度，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行分析。
熔解曲線分析：對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，檢查擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

導(dǎo)出數(shù)據(jù)：

在數(shù)據(jù)分析完成后，用戶可以將分析結(jié)果導(dǎo)出為Excel、PDF等格式，便于進(jìn)一步分析或報(bào)告書(shū)寫(xiě)。

七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的注意事項(xiàng)

清潔儀器：

每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理PCR儀的樣品架和反應(yīng)管，防止樣品污染。
定期清潔儀器表面和熱蓋，避免熒光信號(hào)的干擾。

保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

確保保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和程序設(shè)置，避免數(shù)據(jù)丟失?？梢詫?shù)據(jù)保存在云端或外部存儲(chǔ)設(shè)備上。

檢查儀器運(yùn)行狀態(tài)：

定期檢查儀器的運(yùn)行狀況，包括校準(zhǔn)、溫控系統(tǒng)、熒光檢測(cè)系統(tǒng)等，確保儀器處于最佳工作狀態(tài)。

八、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法

信號(hào)過(guò)低或過(guò)高：

可能原因：模板濃度不適、引物濃度不合適、反應(yīng)體系配制不當(dāng)。
解決方法：適當(dāng)調(diào)整模板濃度和引物濃度，確保反應(yīng)體系的準(zhǔn)確性。

非特異性擴(kuò)增：

可能原因：引物設(shè)計(jì)問(wèn)題、退火溫度設(shè)置不當(dāng)。
解決方法：優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、調(diào)整退火溫度，確保擴(kuò)增特異性。

實(shí)驗(yàn)反應(yīng)失敗：

可能原因：反應(yīng)體系準(zhǔn)備不充分或試劑過(guò)期。
解決方法：檢查試劑是否過(guò)期，確保所有試劑的新鮮度并準(zhǔn)確配制反應(yīng)體系。

總結(jié)

操作賽默飛熒光定量PCR儀需要按步驟配置實(shí)驗(yàn)程序、設(shè)置反應(yīng)體系、選擇合適的熱循環(huán)條件和熒光探針通道。儀器的智能化設(shè)計(jì)使得操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但仍然需要細(xì)致地檢查設(shè)置和反應(yīng)體系，確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。通過(guò)合理設(shè)置和分析，您可以得到高質(zhì)量的定量PCR結(jié)果。

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如何操作賽默飛熒光定量PCR儀

一、準(zhǔn)備工作

二、創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)程序

三、設(shè)置熱循環(huán)條件

四、選擇熒光檢測(cè)通道

五、啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)

六、數(shù)據(jù)分析

七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的注意事項(xiàng)