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　　使用多功能多通道的 PurePep Chorus 對(duì) PNA 合成條件進(jìn)行快速優(yōu)化
 

　　肽核酸(簡稱 PNA )是具有類多肽骨架的 DNA 類似物，且具有多種物理化學(xué)性質(zhì)。PNA 的主鏈骨架是由 N(2-氨基乙基)-甘氨酸與核酸堿基通過亞甲基羰基連接而成的。
 

圖1：肽核酸的結(jié)構(gòu)示意圖，及與 DNA 鍵合
 

　　肽核酸非離子核酸類似物，由于 PNA 不帶負(fù)電荷，與 DNA 和 RNA 之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高，與 DNA 或 RNA 分子的雜交能力遠(yuǎn)優(yōu)于 DNA/DNA 或 DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識(shí)別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。
 

　　PNAs可以通過 RNAs 結(jié)合互補(bǔ)從而抑制基因表達(dá)。并且在特定的條件下，也可以通過鏈入侵機(jī)制與 DNA 雙鏈序列結(jié)合來促進(jìn)基因表達(dá)。基于以上優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，近十年來 PNA 被廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域，高親和力和特異性使它們不僅成為治療劑，而且在診斷的應(yīng)用中也成為有力的工具。
 

　　隨著 PNA 基礎(chǔ)研究的不斷深入和新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，PNA 將顯示出更好的性能和更為廣闊的應(yīng)用前景。
 

　　目前的挑戰(zhàn)
 

　　由于合成過程中容易發(fā)生聚合，且脫保護(hù)過程中有很多副反應(yīng)，PNAs 的合成具有較大的挑戰(zhàn)。針對(duì)容易聚合的問題，通常的策略是在縮合反應(yīng)中使用過量的試劑。但是，用于合成的 N 端保護(hù)的 PNA 單體試劑價(jià)格相對(duì)較高，該方法沒有得到廣泛應(yīng)用。因此，必須開發(fā)出相對(duì)經(jīng)濟(jì)高效的合成工藝才能幫助PNAs 成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。
 

　　在 PurePep Chorus 上進(jìn)行合成條件的優(yōu)化
 

　　在本文中，我們將展示在 PurePep Chorus 自動(dòng)合成儀上實(shí)現(xiàn)對(duì) PNA 的合成條件的的快速優(yōu)化。
 

　　PNA 1 將用于參考序列以考察不同的合成參數(shù)，如 PNA 單體的過量系數(shù)、反應(yīng)時(shí)間以及溫度。合成出 PNA 1 純度最高的條件將被用于合成其他5條長度及嘌呤(腺嘌呤及鳥嘌呤)含量不同的序列(見表1)。純度是考察合成的一個(gè)關(guān)鍵因素，由于 PNA 單體的空間位阻大，容易引起縮合反應(yīng)不完全導(dǎo)致低純度。
 

　　表1：此次案例中涉及的 PNA 序列信息
 

　　PNA 1 使用 PurePep Chorus 多肽合成儀合成，合成當(dāng)量為 25 μmol，使用了取代度為 0.27 mmol/g 的 Rink Amide MBHA 樹脂，并遵循 Fmoc/tBu 正交保護(hù)方案。樹脂上 Fmoc 基團(tuán)的脫保護(hù)使用20%哌啶  DMF 溶液，在室溫下反應(yīng) 5分鐘×2 次；縮合反應(yīng)使用 HCTU 和 NMM 的體系，具體的反應(yīng)細(xì)節(jié)見表2?？s合反應(yīng)結(jié)束后執(zhí)行封端的操作，使用10%醋酸酐  DMF 溶液，室溫下反應(yīng)5分鐘。最后一步脫保護(hù)結(jié)束后，將樹脂放在切割液(TFA: TIS: H2O=95: 2.5: 2.5)中，室溫下反應(yīng)4小時(shí)。
 

　　以上操作可在 Chorus 上根據(jù)所需條件在軟件上設(shè)置不同 Protocol，軟件自動(dòng)計(jì)算所需試劑量，儀器自動(dòng)運(yùn)行，更大化節(jié)省人工操作，并且確保試驗(yàn)方案被嚴(yán)格執(zhí)行。
 

　　表2 縮合條件的研究
 

　　從表2 的數(shù)據(jù)分析我們可以發(fā)現(xiàn)當(dāng) PNA 的反應(yīng)當(dāng)量數(shù)為10倍時(shí)，產(chǎn)物粗品的純度達(dá)到81%；然而基于合成原料 Fmoc-PNA 單體價(jià)格高，上述的設(shè)計(jì)不易被接受。將 PNA 的反應(yīng)當(dāng)量系數(shù)降低到4倍，產(chǎn)物粗品的純度降低到 72%。此時(shí)維持 PNA 的反應(yīng)當(dāng)量系數(shù)在4倍，將反應(yīng)溫度升至 45℃ 并減少縮合時(shí)間至 5 分鐘，產(chǎn)物粗品的純度進(jìn)一步下降到 61%。由此可見，對(duì)于縮合反應(yīng)而言5分鐘反應(yīng)時(shí)間太短。此時(shí)其他條件不變，單獨(dú)將反應(yīng)時(shí)間增加到10分鐘(實(shí)驗(yàn)D)，粗肽純度達(dá)到了82%，與實(shí)驗(yàn)A的結(jié)果相近。實(shí)驗(yàn)E用于進(jìn)一步考察反應(yīng)的條件，反應(yīng)當(dāng)量系數(shù)調(diào)整為2，且做了2次加樣反應(yīng)。使用了總量相同的反應(yīng)原料并在相同的縮合時(shí)間下，產(chǎn)物粗品的純度提高了5%。
 

　　我們根據(jù) PNA 1 產(chǎn)物純度的最高值確定了合成條件，剩下的幾條序列將使用與 PNA 1 相同的方式合成(即方法E)。結(jié)果在表3中顯示：
 

　　表3：使用方法E合成其余5條 PNA 的粗品結(jié)果
 

　　上述5條 PNA 合成后產(chǎn)物的粗品純度在66-91%之間，這樣的結(jié)果對(duì)于肽核酸而言令人滿意。有趣的是，嘌呤含量更高的 PNA 產(chǎn)物擁有更高的純度。
 

　　圖2：5條 PNAs 產(chǎn)物用 UPLC-UV 系統(tǒng)在210nm波長下采集的色譜圖。UPLC系統(tǒng)為 Waters H-class UPLC/ESI-MS，色譜柱為C18 (1.7 μm,2.1 x 50 mm) 。流動(dòng)相為0.1% TFA在水(A)與乙腈(B)混合溶液。
 

　　總結(jié)
 

　　在此應(yīng)用文獻(xiàn)中，我們?cè)敿?xì)討論了使用 PurePep Chorus 系統(tǒng)優(yōu)化 PNA 合成的方法。最初我們使用了10倍反應(yīng)當(dāng)量的 PNA 在室溫下縮合反應(yīng)1小時(shí)，這樣的方法可以獲得純度達(dá)到81%的產(chǎn)物粗品。我們致力于降低反應(yīng)物的用量，并將其對(duì)粗品純度的影響降到最低從而讓該反應(yīng)更加經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)、更符合綠色化學(xué)的要求。最終我們開發(fā)出了既減少反應(yīng)物用量，純度又高的方法。使用2次縮合的方式，每一次加樣用2倍的反應(yīng)當(dāng)量，在45℃條件下反應(yīng)5分鐘，可以將PNA 1的粗品純度從81%提升到87%。最后該方法倍應(yīng)用到了其他5條 PNA 的合成上。
 

　　對(duì)于不同長度及不同嘌呤含量的肽核酸，該方法都能得到很不錯(cuò)的產(chǎn)物。PurePep Chorus 多肽合成儀對(duì)該工作是一個(gè)很好的工具，因?yàn)楹铣傻姆桨缚梢愿鶕?jù)需要靈活調(diào)整；比如修改反應(yīng)當(dāng)量系數(shù)、重復(fù)次數(shù)、溫度及時(shí)間。同時(shí)，自動(dòng)化的儀器及軟件的自動(dòng)計(jì)算功能幫助減少人工操作，降低失誤風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)化后的合成條件可以被輕松的應(yīng)用于其他 PNAs 合成。