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為什么研究線粒體

線粒體在健康和疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，不僅是能量產(chǎn)生的關(guān)鍵，還有很多其他功能。線粒體功能的破壞可以使用各種熒光試劑盒來檢測(cè)，包括線粒體鈣、超氧化物、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換和膜電位的檢測(cè)。

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線粒體的其他功能 ^[1]：

· 離子穩(wěn)態(tài)：從鐵和鈣的穩(wěn)態(tài)到激素和神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生，都離不開線粒體。特別是在鈣穩(wěn)態(tài)中，線粒體作為調(diào)節(jié)者、緩沖池和傳感器參與細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)。線粒體可以儲(chǔ)存和釋放鈣，從而影響細(xì)胞質(zhì)中鈣峰值的形狀、頻率和幅度，這對(duì)于各種細(xì)胞過程都緊密相關(guān)。

· 胞內(nèi)、胞外交流：線粒體與其他細(xì)胞器和環(huán)境相互作用，影響各個(gè)生理層面的交流。線粒體是細(xì)胞間通訊的核心，在復(fù)雜的調(diào)節(jié)活動(dòng)和細(xì)胞間通訊中充當(dāng)信號(hào)細(xì)胞器。線粒體與細(xì)胞核之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中扮演關(guān)鍵角色。

· 免疫系統(tǒng)：線粒體可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能及其對(duì)感染的反應(yīng)。線粒體負(fù)責(zé)產(chǎn)生免疫細(xì)胞激活、增殖和行使功能所需的能量。線粒體還參與活性氧的產(chǎn)生，這對(duì)于免疫細(xì)胞的抗菌能力相當(dāng)重要。此外，線粒體還參與免疫細(xì)胞死亡和炎癥的調(diào)節(jié)。位于線粒體外膜上的線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）在病毒感染的免疫反應(yīng)中至關(guān)重要。因此，線粒體健康與免疫系統(tǒng)功能息息相關(guān)。

· 腸道微生物群：腸道微生物群可以影響線粒體新生，從而影響能量產(chǎn)生和其他線粒體功能。線粒體可以通過產(chǎn)生活性氧和其他代謝物來影響腸道微生物群的組成。線粒體和腸道微生物群之間的這種相互作用對(duì)于維持腸道健康來說是非常重要的，并且與多種疾病有關(guān)，包括代謝綜合征、炎癥性腸病和神經(jīng)退行性疾病。

· 生物鐘：據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，線粒體活動(dòng)和動(dòng)態(tài)會(huì)影響晝夜節(jié)律，并且線粒體與晝夜系統(tǒng)相互作用以調(diào)節(jié) NAD+ 等關(guān)鍵分子的生物合成。

線粒體功能障礙與疾病的關(guān)系

線粒體功能障礙與多種疾病相關(guān)，包括代謝綜合征、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、心血管疾病、傳染病以及炎癥性疾病，下面是幾個(gè)例子：

· 代謝綜合征：線粒體功能障礙可能導(dǎo)致代謝綜合征，這種疾病的特征包括高血壓、高血糖和膽固醇水平異常等一系列癥狀，這些疾病會(huì)增加患心臟病、中風(fēng)和二型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。

· 神經(jīng)系統(tǒng)疾病：線粒體功能障礙與阿爾茨海默病、帕金森氏癥側(cè)索硬化 (ALS) 等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。線粒體功能障礙可能導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少和活性氧產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。

· 癌癥：線粒體代謝的改變可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展。線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生增加，從而導(dǎo)致 DNA 損傷和突變，促進(jìn)癌癥的發(fā)展。

· 心血管疾病：線粒體功能障礙可能會(huì)損害心肌產(chǎn)生能量的能力，從而導(dǎo)致心臟疾病，包括心力衰竭、心律失常和其他心血管疾病。

· 炎癥性疾?。?/span>線粒體功能障礙可引發(fā)慢性炎癥，導(dǎo)致各種炎癥性疾病的發(fā)展，包括自身免疫性疾病。

線粒體研究的工具

線粒體形態(tài)&定位研究

根據(jù)樣品類型和具體應(yīng)用，線粒體結(jié)構(gòu)標(biāo)記匯總?cè)缦拢?/span>

MitoTracker 標(biāo)記探針

MitoTracker 探針是小分子 (<1 kDa)、細(xì)胞滲透性線粒體選擇性染料，含有硫醇反應(yīng)性氯甲基，部分探針可在固定后保持染料與線粒體結(jié)合。由于探針與線粒體硫醇形成共價(jià)鍵，因此它們只能用作終點(diǎn)測(cè)定，以檢測(cè)活細(xì)胞的線粒體膜電位，不能隨時(shí)間動(dòng)態(tài)檢測(cè)線粒體膜變化。

圖1. 在A549細(xì)胞中使用 MitoTracker™ Red CMXRos (貨號(hào) M7512) 染色線粒體

CellLight熒光融合蛋白

當(dāng)需要在活細(xì)胞中不依賴于膜電位標(biāo)記線粒體并跟蹤細(xì)胞的行為動(dòng)態(tài)時(shí)，推薦使用 CellLight 試劑，操作簡(jiǎn)單、可與其他試劑共用，也可以固定。

圖2. 在HeLa細(xì)胞中使用CellLight™ Mitochondria-GFP (貨號(hào)C10600) 標(biāo)記線粒體

線粒體蛋白抗體

線粒體標(biāo)記抗體特異性檢測(cè)線粒體蛋白，可以幫助研究線粒體的形態(tài)和動(dòng)力學(xué)以及其他相關(guān)的生理病理狀態(tài)。常見的線粒體靶點(diǎn)有細(xì)胞色素c氧化酶（COX），氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶線粒體F1復(fù)合體，熱休克蛋白60，抗增殖蛋白Prohibitin等。

圖3. 在印度麂鹿皮成纖維細(xì)胞中用小鼠抗 OxPhos Complex V 抑制劑蛋白抗體標(biāo)記線粒體，搭配二抗 Alexa Fluor™ 555 山羊抗小鼠 IgG (貨號(hào) A21422)

線粒體功能分析

線粒體的損傷包括線粒體氧化還原電位和膜電位的變化，后者是線粒體健康的一個(gè)核心特征。

線粒體內(nèi)膜電位對(duì)Ca²⁺的吸收和儲(chǔ)存、活性氧的產(chǎn)生和解毒作用至關(guān)重要，其中最重要的是氧化磷酸化合成ATP ^[2]。

因此，膜的去極化是評(píng)價(jià)線粒體功能障礙的良好指標(biāo)，這與藥物毒性的相關(guān)性越來越高 ^[3-7]。

膜電位的變化，以及ATP與ADP比率的降低、線粒體基質(zhì)鈣水平的增加、氧化應(yīng)激和胞質(zhì)細(xì)胞色素c的釋放均被認(rèn)為與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換有關(guān)，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔 (MPTP) 可以改變離子和小分子的穩(wěn)態(tài)。

線粒體功能的破壞可以使用各種熒光試劑盒來檢測(cè)，包括線粒體鈣、超氧化物、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換和膜電位的檢測(cè)。

線粒體膜電位動(dòng)態(tài)變化的檢測(cè)

線粒體膜電位的終點(diǎn)檢測(cè)

線粒體超氧化物生成的檢測(cè)

細(xì)胞超氧化物生成的增加與多種疾病狀態(tài)有關(guān) ^[8]。它是氧化磷酸化的副產(chǎn)物，因此提供了另一種評(píng)估線粒體健康和細(xì)胞狀態(tài)的方法。

圖4. 在U2OS細(xì)胞中用MitoSOX™ Green (貨號(hào)M36005) 檢測(cè)線粒體超氧化物

線粒體鈣離子檢測(cè)

線粒體Ca²⁺ 濃度升高在啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡（凋亡）以及其他細(xì)胞水平的過程中起著重要作用 ^[9]。熒光探針在結(jié)合Ca²⁺ 時(shí)表現(xiàn)出光譜響應(yīng)，使研究人員能夠使用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞分析和熒光光譜法研究細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺ 濃度的變化。

圖5. 線粒體鈣水平和動(dòng)力學(xué)的多參數(shù)成像。（A）用CellLight Mitochondria-GFP和5μM Rhod-2 AM在37℃下標(biāo)記HeLa細(xì)胞15分鐘，成像時(shí)間超過100秒。（B–D）為區(qū)域（A）放大的圖像，展示隨著時(shí)間的推移，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的單個(gè)線粒體。（C，D）當(dāng)用10μM組織胺處理后，鈣從內(nèi)部被釋放出來。Rhod-2橙紅色熒光的增加揭示了線粒體緊鄰鈣釋放的位置。（C）中的箭頭表示線粒體可能損害了鈣吸收，如果單獨(dú)使用Rhod-2 AM檢測(cè)，可能會(huì)遺漏這一細(xì)節(jié)。星號(hào)表示單個(gè)線粒體，顯示鈣水平暫時(shí)升高。

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔變化的檢測(cè)

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔 (MPTP) 是位于線粒體內(nèi)外膜的非特異性通道，研究表示，參與細(xì)胞死亡過程中線粒體成分的釋放。MPTP的開關(guān)極大地改變了線粒體的滲透性以及線粒體膜電位。這種持續(xù)孔隙激活是由線粒體Ca²⁺ 超載、線粒體谷胱甘肽氧化、線粒體活性氧水平升高和其他促凋亡條件引起的。

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