諾博萊德 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒 核酸提取

EndoFree Plus Plasmid Maxi Kit無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(增強(qiáng)型)

目錄號(hào)：31113-10

產(chǎn)品內(nèi)容：

保存條件：

在室溫(15 ~ 25℃)干燥條件下，可保存 12 個(gè)月。

RNase  A、內(nèi)毒素清除劑，可常溫運(yùn)輸，-20℃保存。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒可提取 100-300ml 菌液，采用改進(jìn)的 SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，通過(guò)獨(dú)te的內(nèi)毒素清除劑選擇性結(jié)合離心除去內(nèi)毒素，然后離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。所得質(zhì)?？芍苯佑糜诿盖?、轉(zhuǎn)化、PCR、RT-qPCR、測(cè)序及轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.        獨(dú)te工藝配方清除內(nèi)毒素，內(nèi)毒素含量極低（< 0.1 EU/ug DNA），細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果極jia。

2.        得率高： 150 – 300 ml 菌液可提出多達(dá) 500– 2000 ug 的純凈質(zhì)粒。

重要提示：

一、使用前請(qǐng)先檢查平衡液、溶液 P2 和溶液 N3 是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃

水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過(guò)量的泡沫。

二、第一次使用前請(qǐng)先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB 中加入指ding量無(wú)水乙醇（見(jiàn)瓶身標(biāo)簽），充分混勻，并做好標(biāo)記，以免多次加入。

三、首ci使用時(shí)請(qǐng)先將 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混勻，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步驟：

1.   取 150 ~ 200 ml（最多 300ml）過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，室溫 9,000 rpm 離心 1 min，盡量倒干上清，收集菌體。

（注意： 如果用 50ml 離心管收集菌體，離心棄上清后，在同一管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟 1）

2. 加入 7.5 ml 溶液 P1，重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至徹di懸浮。

（注意：如有未徹di懸浮的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取的質(zhì)粒濃度及純度降低）

3.  加入 7.5 ml 溶液 P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時(shí)間不要超過(guò) 5 min，以免質(zhì)粒受到破壞，如未完quan變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量，在后續(xù)的操作中溶液 P3 的用量也要相應(yīng)增加）

4.  加入 7.5 ml 溶液N3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，

然后室溫 9,000 rpm 離心 10 min,小心取上清至新管。

（注意：加入溶液 N3 后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生 SDS 的局部沉淀）

5.  加入 0.1 體積(上清的體積的 10%，約 2.4 ml)的內(nèi)毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒

旋轉(zhuǎn)混勻。冰浴(或冰箱冷凍室)放置 5 分鐘，直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁），中間偶爾混勻幾次。

（注意：內(nèi)毒素清除劑加入上清后，上清會(huì)變得渾濁，但是冰浴后應(yīng)恢復(fù)清亮,或稍渾濁。）

6. 常溫放置 3 ~ 5 分鐘，溶液很快變?yōu)闇啙?，顛倒混勻?/span>（37℃水浴可加速渾濁）

7. 室溫 9,000 rpm 離心 10 min 分相。上層水相含 DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。將含 DNA 的上層水相（上清）轉(zhuǎn)移到新管，棄油狀層。

8.加入 0.5 倍上清體積的異丙醇（約 11 ml）,充分顛倒混勻，分兩次（每次不超過(guò) 10 ml）轉(zhuǎn)入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），9,000 rpm 離心 1min，質(zhì)粒被吸附在膜上，倒棄收集管中的濾液，直到所有混合溶液通過(guò)此吸附柱。

9.可選步驟：向吸附柱中加入 10 ml 去蛋白液 PE，室溫 9,000 rpm 離心 1 min，棄濾液。

（注意：去蛋白液 PE 為濃縮液，按要求加入無(wú)水乙醇，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α，此步驟可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步驟不可省略，因這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒。如果提取低拷貝質(zhì)粒也推薦采用此步驟）

10.    加入 10 ml 漂洗液 WB，室溫 9,000 rpm 離心 1 min，棄濾液。

（注意：漂洗液 WB 為濃縮液，按要求加入無(wú)水乙醇，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

11.      重復(fù)步驟 10 一次。

12.   將吸附柱放進(jìn)收集管，室溫 9,000 rpm 離心 3 min，甩干膜上殘留乙醇。

13. 將吸附柱置于一個(gè)新的 50 ml 離心管（自備）中，加入 1 ~ 2 ml 的洗脫緩沖液EB，室溫放置 2 min，9,000 rpm 離心 2 min，離心管底溶液即質(zhì)粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預(yù)熱洗脫緩沖液 EB，可增加洗脫效率；

如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心 1 min 收集；如需使用去離子水洗脫，可用 NaOH 調(diào)整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之間。）

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