轉染級質粒大提試劑盒(溶液型) 核酸提取

EndoFree Plasmid Maxi Kit轉染級質粒大量提試劑盒（溶液型）

目錄號：31114-20

產(chǎn)品內(nèi)容：

保存條件：

在室溫 (15 ~ 25℃) 條件下，可保存 12 個月。

RNase  A、內(nèi)毒素清除劑，可常溫運輸，-20℃保存。

適用范圍：

特別適合用于大量轉染級質粒的制備，以及 BAC/PAC 等大型質粒的制備。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

產(chǎn)品簡介：

采用獨te的溶液配方和內(nèi)毒素清除試劑，只需要幾次簡單的離心，就可以去除蛋白質、多糖、內(nèi)毒素、RNA 等雜質，獲得高質量的轉染級質粒 DNA，可直接應用于細胞轉染甚至動物體內(nèi)實驗等對 DNA 純度要求很高的工作中。

本方法提取純化質粒 DNA，對質粒損傷小，即使是 10kb 甚至 100kb 以上的大型質粒或超大型 BAC/PAC 質粒，都可以有效純化。獲得的質粒產(chǎn)量高，濃度可高達 5ug /ul，超螺旋比例可高達 95%，無內(nèi)毒素，轉染效果極jia。

重要提示：

一、環(huán)境溫度低時溶液 P2 中 SDS 可能會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

二、提取大質粒時, 操作動作要輕柔，剪掉一部分吸頭的尖嘴，以增大開口，防止機械剪切對 DNA 的損壞。

三、提取的質粒量與細菌培養(yǎng)濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質?；虼笥?nbsp;10kb 的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加 P1、P2、P3 的用量。

四、得到的質粒 DNA 電泳時可能為單一條帶，也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 95%。

五、首ci使用時請先將 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混勻，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步驟：

1.   取 150 ml（最多 200ml）過夜培養(yǎng)的菌液，12,000 x g 于 4℃離心 2 min，盡量倒干上清，收集菌體。

（注意： 如果用 50 ml 離心管收集菌體，離心棄上清后，在同一管內(nèi)加入更多的菌液，重復步驟 1，直到收集到足夠多的菌體）

2.  加入 5 ml 溶液P1，重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至徹di懸浮, 室溫放置3~5分鐘。

（注意：如有未徹di懸浮的菌塊會影響裂解，導致提取的質粒濃度及純度降低）

3. 加入 5 ml 溶液P2，溫和地上下翻轉 6-8 次，使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時間不要超過 5 min，以免質粒受到破壞，如未完quan變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量，在后續(xù)的操作中溶液 P3 的用量也要相應增加）

4. 加入 5 ml 溶液P3，立即溫和地上下翻轉 6-8 次，充分混勻，至白色絮狀物產(chǎn)生，然后

12,000 x g 于 4℃離心 10 ~ 15 min, 小心取上清，移入新的 50 ml 離心管中。

（注意：加入溶液 P3 后應立即混合，避免產(chǎn)生 SDS 的局部沉淀）

5.加入 10 ml 異丙醇，上下顛倒離心管，充分混勻。

6.   在 4℃條件下 12,000~16,000 x g 離心 10 min，小心棄去上清，倒置輕輕瀝干殘余液體，加入 3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速離心 5 分鐘，棄上清，晾干沉淀。

（注意：DNA 沉淀如果干燥過頭，DNA 將無法完quan溶解，但是如果乙醇沒有晾干揮發(fā)干凈，殘留太多，也會造成 DNA 無法完quan溶解。）

7.  加入 1.4 ml 溶液P1 完quan溶解沉淀團塊，注意附著在側壁上的質粒沉淀雖然看不見，也

要吹打側壁涮洗下來（大質粒可用寬口吸管輕輕吹打輔助溶解）。然后將質粒溶液轉入

2 個新的 1.5 ml 離心管中（每個 700 ul）。

8.        可選步驟（一般不需要）：如果菌株 RNA 豐富有微量 RNA 殘留，可在此步驟后將質粒溶液 60℃孵育 15 min 消化 RNA。

9.每管加入 55 ul 雜質清除液 A，顛倒充分混勻后, 加入約 0.1 體積 (約 80ul ) 冰預冷的內(nèi)毒素清除劑，顛倒旋轉 7-10 次（30 秒左右）充分混勻，上清會變得渾濁，冰浴或者冰上放置>=5 min，中間偶爾顛倒混勻幾次，上清恢復清亮。

(注意：如果不需要去內(nèi)毒素用于轉染，可在此步驟只加入 55 ul 雜質清除液A，充分混勻后冰上放置 5 分鐘，離心后小心取上清轉入一個新管，直接接步驟 12。)

10.     42℃水浴，溶液又會變?yōu)闇啙幔嵉够靹蚝?nbsp;42℃溫育 5 分鐘。

11.     室溫 14,000 x g 離心 5 min 分相，上層水相含 DNA，下層藍色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質。將含DNA 的上層水相轉移到新管（注意不要吸到藍色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質），棄油狀層。

溶液必須分為上下兩相，否則應重復步驟 10-11。

（溫度低時，內(nèi)毒素清除劑無法分相，因此必須 20℃以上室溫離心或者保證冬季轉頭溫度 20℃以上）

12.     將上一步所得上層水相中加入等體積雜質清除液B（約 750 ul），輕柔混勻，14,000 x g于 4℃離心 10 min，棄上清（注意不要丟失 DNA），輕輕加入 1 ml 70%乙醇洗滌，離心棄上清，再用 1 ml 70%乙醇洗滌一次，室溫倒置晾干 5~10 min 使乙醇完quan揮發(fā)。

13.     每個離心管加 100~200 ul 純水或者 TE 溶解沉淀（可在 37℃水浴中振蕩以輔助溶解）。要注意很多質粒 DNA 可能附著在離心管側壁上，即使看不見，也應該充分吹打側壁溶解回收質粒 DNA。（質粒 DNA 可以根據(jù)需要，選擇任意小體積的純水溶解，濃度可達 5-10ug/ul）

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