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兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基

細(xì)胞介紹

該細(xì)胞對(duì)乳汁珠和激活的紅細(xì)胞有吞噬作用，無(wú)表面和胞質(zhì)免疫球蛋白。可以用佛波醇 TPA誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化。

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：急性單核細(xì)胞白血病，單核細(xì)胞

2） 形態(tài)：單核細(xì)胞，懸浮

3） 含量：>1x106細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

運(yùn)輸和保存：干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理：

1） 收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）請(qǐng)?jiān)?/span>4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3） 懸浮細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基）。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；0.05 mM β－巰基乙醇(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí) )；雙抗，1%。

2） 參考傳代比例：傳代時(shí)控制細(xì)胞密度在2-4 ×10⁵cell / mL，并在細(xì)胞生長(zhǎng)至8-10 ×10⁵cell / mL時(shí)進(jìn)行傳代。

3） 參考換液頻率：傳代時(shí)換液

4） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

5） 凍存液：培養(yǎng)液95%，DMSO 5%（使用該凍存液后，按照我?guī)斓慕?jīng)驗(yàn)復(fù)蘇存活率約50%，復(fù)蘇后需要額外培養(yǎng)7-10天才能恢復(fù)生長(zhǎng)）

6） 【注意事項(xiàng)】：

該細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)以及客戶的反饋，傳代時(shí)使用【半換液法】對(duì)細(xì)胞狀態(tài)較為有利，因此我?guī)旖ㄗh您使用【半換液法】進(jìn)行傳代。

1. 您在收到我們提供的用15ml離心管發(fā)貨的細(xì)胞后，請(qǐng)不要通過(guò)離心的方式收集細(xì)胞，可以先準(zhǔn)備兩個(gè)新的T25培養(yǎng)瓶，然后將細(xì)胞混合均勻后移入兩個(gè)新的T25培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)基到10ml。放入到37℃培養(yǎng)箱中。

2. 您在收到的是用T25培養(yǎng)瓶發(fā)貨的細(xì)胞，請(qǐng)先通過(guò)離心的方式收集細(xì)胞，然后將細(xì)胞重懸加入12ml按照說(shuō)明書要求配置的培養(yǎng)基吹打均勻后移入兩個(gè)新的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)即可。

3. thp-1懸浮細(xì)胞。該細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)更喜歡溫和處理，培養(yǎng)時(shí)盡量少對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心處理以此造成對(duì)細(xì)胞的傷害。換液時(shí)不要全培養(yǎng)基更換，建議您使用【半換液法】進(jìn)行傳代，添加細(xì)胞培養(yǎng)基以稀釋細(xì)胞至維持密度即可。

4. 細(xì)胞對(duì)血清質(zhì)量較為敏感，我?guī)旖ㄗh您使用進(jìn)口品牌優(yōu)質(zhì)血清進(jìn)行培養(yǎng)。FBS不要滅活，如果細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢請(qǐng)嘗試使用其他FBS或暫時(shí)將FBS濃度增加到20%

5.該細(xì)胞的培養(yǎng)液中需添加βME（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別），若不添加，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)造成影響。

βME的穩(wěn)定性有限，不可將βME添加到培養(yǎng)基中長(zhǎng)期儲(chǔ)存，在每次傳代或液體添加時(shí)再添加βME。

βME（2-βME）被添加到淋巴細(xì)胞或其他細(xì)胞培養(yǎng)物中，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基中使用的FBS中氨基酸半胱氨酸供不應(yīng)求，而胱氨酸則很多。有些細(xì)胞（例如T細(xì)胞）無(wú)法將半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，必須將其轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。βME將胱氨酸還原為可被細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的形式，然后轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生長(zhǎng)所需的半胱氨酸。βME還是一種還原劑，可以分解培養(yǎng)中細(xì)胞產(chǎn)生的許多有毒代謝產(chǎn)物，從而改善細(xì)胞周圍的環(huán)境。

6.該細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度較為敏感，培養(yǎng)、傳代時(shí)請(qǐng)注意保持細(xì)胞密度在合適的范圍（具體請(qǐng)參考細(xì)胞說(shuō)明書）。

7..該細(xì)胞凍存后復(fù)蘇率較低，凍存時(shí)請(qǐng)酌情提高細(xì)胞量

8.通常情況下可以通過(guò)向正在生長(zhǎng)的細(xì)胞中添加培養(yǎng)基來(lái)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，每7天可以將細(xì)胞離心并重懸于新配的培養(yǎng)基中，來(lái)完成細(xì)胞的全換液。

（頻繁的細(xì)胞計(jì)數(shù)是監(jiān)測(cè)thp-1的優(yōu)良方法。這些細(xì)胞應(yīng)該每2至3天通過(guò)向燒瓶中簡(jiǎn)單加入少量新鮮培養(yǎng)基（使它們具有條件培養(yǎng)基）來(lái)培養(yǎng)。您不需要每次都離心細(xì)胞并重新傳代。當(dāng)在我們的實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)時(shí)，到第2天，細(xì)胞通常可以擴(kuò)增到具有更多培養(yǎng)基的更大的燒瓶中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到8×10 ⁵個(gè)活細(xì)胞/ ml時(shí)需要進(jìn)行傳代。不允許細(xì)胞密度超過(guò)1×10（6）活細(xì)胞/ ml。）

二． 細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞換液: 通常情況下可以通過(guò)向正在生長(zhǎng)的細(xì)胞中添加培養(yǎng)基來(lái)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)，每7天可以將細(xì)胞離心并重懸于新配的培養(yǎng)基中，來(lái)完成細(xì)胞的全換液。

3） 細(xì)胞傳代：傳代時(shí)控制細(xì)胞密度在2-4 ×10⁵cell / mL，并在細(xì)胞生長(zhǎng)至8-10 ×10⁵cell / mL時(shí)進(jìn)行傳代。

3） 細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。    

1，細(xì)胞凍存時(shí)，取上清，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

      2，4min ，1000rpm 離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入凍存液，輕輕混勻，DMSO終濃度為5%，細(xì)胞密度2x10⁶/支，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

注意事項(xiàng)：

1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒(méi)在液氮中會(huì)泄漏，并會(huì)慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害

兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基