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OVCAR-8/ADR 人卵巢癌腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞

細(xì)胞介紹

OVCAR-8/ADR為由OVCAR-8細(xì)胞構(gòu)建的耐ADR藥物細(xì)胞株。

細(xì)胞特性

1） 來源：高級別卵巢漿液性腺癌  女  64歲

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣  貼壁生長

3） 含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理

1.  收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、漏液及細(xì)胞有污染；或凍存管有破損，融化、漏液等，請立即拍照并聯(lián)系我們。照片包括細(xì)胞培養(yǎng)瓶/凍存管外觀，顯微鏡下細(xì)胞照片（100倍，200倍各2張）；

2.若收到的復(fù)蘇細(xì)胞有少量細(xì)胞脫落、飄起，可能由于運(yùn)輸途中導(dǎo)致。請先于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置2~3h后，再進(jìn)行處理；

復(fù)蘇細(xì)胞的充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基，血清濃度較低，收到細(xì)胞后請及時更換為專用培養(yǎng)基；

3.建議收到細(xì)胞后，首先進(jìn)行擴(kuò)增（至少3代），并凍存部分細(xì)胞以備用。

4.初次培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)約80%時，可加入400ng/mL ADR的專用培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞專用融合后傳代。細(xì)胞傳代1~2次后仍能保持增殖，即可提高藥物濃度至最大500ng/mL繼續(xù)培養(yǎng)；若此過程中細(xì)胞停止增殖，且狀態(tài)較差，則需降低藥物濃度（降低一半藥物濃度）或使用不含藥物的專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右，且生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的ADR藥物濃度。

5.細(xì)胞凍存過程中，不可添加藥物。

6.備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的專用培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。                  

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1.  準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%

  細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制

1）ADR藥物的配制及保存

建議將ADR藥物配制成1mg/mL的母液，即使用10mL PBS溶液溶解10mg ADR藥物，使其專用溶解后，使用0.22um濾器過濾除菌。

注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效。溶解后的Taxol，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。

2）凍存液的配制

90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。（凍存液中不含藥物）

3）專用培養(yǎng)基的配制

2  培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3  凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

細(xì)胞處理

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL專用培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL專用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，均勻鋪于含6~8mL專用培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

注意：①細(xì)胞復(fù)蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞生長至匯合度達(dá)80%左右時，方可添加400ng/mL ADR藥物；若細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低ADR的濃度（降低一半藥物濃度），或使用不含藥物的專用培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的ADR濃度。

②建議復(fù)蘇細(xì)胞時始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩，避免凍存管處于溫差較大情況下發(fā)生爆炸，造成人員傷害。

2）細(xì)胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶至細(xì)胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。 

④將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細(xì)胞沉淀中加入1~2mL專用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕吹混勻。將細(xì)胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL專用培養(yǎng)基。

注意：細(xì)胞傳代1~2次后仍能保持增殖，即可提高藥物濃度至500ng/mL繼續(xù)培養(yǎng)；若此過程中細(xì)胞停止增殖，且狀態(tài)較差，則需降低藥物濃度（降低一半藥物濃度）或使用不含藥物的專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞匯合度約80%，且生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的ADR藥物濃度。

3）細(xì)胞凍存

①細(xì)胞凍存時，步驟同2）細(xì)胞傳代的①~④，細(xì)胞計數(shù)后，加入配制好的細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞，按照1×106 ~ 1×107個細(xì)胞/mL分配到一個凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

注意：細(xì)胞凍存過程中，不可添加藥物。

②將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)

1.收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2.收到細(xì)胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù)。

3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?，故本公司只保證客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細(xì)胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

4.所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

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