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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

RT-LAMP MasterMix（熒光染料法）含有熒光 RT-LAMP 擴(kuò)增所需的所有成分，可以用于實(shí)時(shí)熒光（但非定量）RT-LAMP 等溫?cái)U(kuò)增。RT-LAMP 即 Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification（逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增），它利用 4 條模板專(zhuān)一的特異引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和具有鏈置換能力的 Bst DNA 聚合酶，在等溫條件下(65℃左右) 30－60 分鐘完成逆轉(zhuǎn)錄和LAMP 擴(kuò)增。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于定性 RT-PCR 技術(shù)。目前已成功應(yīng)用于生物的快速檢測(cè)，廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開(kāi)即用，含有 LAMP 專(zhuān)用的熒光染料，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)（需要熒光 PCR 儀），但不建議用于定量分析。

2.高特異性，精心優(yōu)化的配方，非特異擴(kuò)增比自配的試劑更低。

3.高擴(kuò)增效率，一般比 RT-PCR 靈敏一個(gè)數(shù)量級(jí)。

4.65℃左右同時(shí)完成逆轉(zhuǎn)錄和等溫?cái)U(kuò)增，一步式操作。

5.本試劑盒足夠 50 次 20 ?L 體系的實(shí)時(shí)熒光 RT-LAMP 擴(kuò)增。

6.提供擴(kuò)增對(duì)照，便于在遇到困難時(shí)分析原因。

7.20 ?L 體系最多可以使用 13 ?L 樣本，減少漏檢。

8.RT-LAMP MasterMix（熒光染料法）只能用于科研，不能用于臨床。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

成分規(guī)格包裝

RT-LAMP MasterMix

（熒光染料法，待加酶）200 ?L0.5 mL 綠蓋管

逆轉(zhuǎn)錄酶-擴(kuò)增酶混合液100 ?L0.5 mL 紅蓋管

LAMP 陽(yáng)性對(duì)照

模板-引物混合物50 ?L0.5 mL 藍(lán)蓋管

使用手冊(cè)1 份無(wú)

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

RNA 模板、RT-LAMP 引物

使用方法：

1.制備模板RNA：用于選用合適的方法制備模板RNA。如果有N個(gè)樣品，最好設(shè)置N+2個(gè)樣品制備，多出的兩個(gè)一個(gè)是樣品制備陽(yáng)性對(duì)照，一個(gè)是樣品制備陰性對(duì)照。

2.配制20×RT-LAMP引物混合液。

先加超純水將合成的HPLC級(jí)別的下列引物干粉稀釋到下表所標(biāo)注的母液

濃度，然后在一新的離心管中按表中所列體積加入各種引物母液和超純水， 最后得到0.1 mL的20×RT-LAMP引物混合液，此混合液足夠100次20 ?L

體系的RT-LAMP擴(kuò)增。如果需要配制的20×RT-LAMP引物混合液體積異 于0.1 mL，則各成分的用量請(qǐng)按比例調(diào)整。引物混合液可以在-20℃放置2 年。

注：如果沒(méi)有Loop引物，則用水替代。

3.在冰上融化RT-LAMP MasterMix（熒光染料法，待加酶），混勻，稍離心。第一次使用時(shí)，請(qǐng)將100uL逆轉(zhuǎn)錄酶-擴(kuò)增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix中并輕柔顛倒混勻1分鐘，然后再使用。如果有N個(gè)樣品，則在 N+2個(gè)反應(yīng)管中加入以下組份，多出的一管是RT-LAMP擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照

（PC），一管是RT-LAMP擴(kuò)增陰性對(duì)照（NC）：

成份N+2 個(gè)樣品管RT-LAMP

擴(kuò)增PCRT-LAMP

擴(kuò)增 NC

RT-LAMP MasterMix

（含熒光染料，加酶后）6 ?L6 ?L6 ?L

自備 20×RT-LAMP

引物混合液1 ?L不加1 ?L

LAMP 陽(yáng)性對(duì)照

模板-引物混合物不加4 ?L不加

自備模板 RNA1-13 ?L不加不加

補(bǔ)自備超純水到20 ?L20 ?L20 ?L

4.混勻，放熒光定量PCR儀器上65℃保溫90分鐘，每分鐘采集一次SYBR通道的熒光信號(hào)。

5.結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)有效性判定。如果兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照能夠得到標(biāo)準(zhǔn)的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)而兩個(gè)陰性對(duì)照都沒(méi)有擴(kuò)增，則實(shí)驗(yàn)有效，才有必要對(duì)樣品進(jìn)行分析。如果陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線(xiàn)，則說(shuō)明試劑盒可能失效，實(shí)驗(yàn)無(wú)效。如果陰性對(duì)照有S型擴(kuò)增曲線(xiàn)，則說(shuō)明LAMP引物設(shè)計(jì)得不好，有非特異擴(kuò)增， 需要重新優(yōu)化引物。也可能是環(huán)境或試劑有污染，實(shí)驗(yàn)無(wú)效。遇到實(shí)驗(yàn)無(wú)效的情況，請(qǐng)跟廠家客戶(hù)聯(lián)系，分析原因后再恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。

6. 如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析樣品。凡是有S擴(kuò)增曲線(xiàn)的，可以判斷為陽(yáng)性。凡是

沒(méi)有S擴(kuò)增曲線(xiàn)的，可以判斷為陰性。典型的熒光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下圖。左邊為陽(yáng)性結(jié)果，擴(kuò)增曲線(xiàn)為S型，右邊為陰性結(jié)果，擴(kuò)增曲線(xiàn)不呈S型。

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