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大鼠游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個月

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠游離脂肪酸（FFA）水平。用純化的大鼠游離脂肪酸（FFA）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入游離脂肪酸（FFA），再與 HRP  標(biāo)記的游離脂肪酸（FFA）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹-底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的游離脂肪酸（FFA）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠游離脂肪酸（FFA）濃度。

試劑盒組成

130 倍濃縮洗滌液20ml×1 瓶7終止液6ml×1 瓶

2酶標(biāo)試劑6ml×1 瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（1600µmol/L）0.5ml×1 瓶

3酶標(biāo)包被板12 孔×8 條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1 瓶

4樣品稀釋液6ml×1 瓶10說明書1 份

5顯色劑A 液6ml×1 瓶11封板膜2 張

6顯色劑 B 液6ml×1/瓶12密封袋1 個

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

800µmol/L5 號標(biāo)準(zhǔn)品150µl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

400µmol/L4 號標(biāo)準(zhǔn)品150µl 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

200µmol/L3 號標(biāo)準(zhǔn)品150µl 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

100µmol/L2 號標(biāo)準(zhǔn)品150µl 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

50µmol/L1 號標(biāo)準(zhǔn)品150µl 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 150µl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．大鼠游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒不同批號組分不得混用。