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Extracellular signal-regulated kinase（ERK）是胚胎發(fā)生，細(xì)胞分化，細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡調(diào)控的關(guān)鍵組成部分。ERK途徑起源于質(zhì)膜中的活化受體，并通過(guò)Ras/Raf/MEK至ERK（圖1）。

圖1. Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)將信號(hào)從細(xì)胞表面受體如EGF受體（EGFR）傳播到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。ERK是該途徑的終組分，并且在被生長(zhǎng)因子（例如EGF（表皮生長(zhǎng)因子））激活后，觸發(fā)下游效應(yīng)，如激酶或轉(zhuǎn)錄因子的激活。

該途徑被不同類(lèi)型的受體激活，包括受體酪氨酸激酶 （例如EGF受體）以及G蛋白偶聯(lián)受體。作為信號(hào)傳導(dǎo)途徑的終組分，ERK磷酸化不同的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，包括大量其他激酶和轉(zhuǎn)錄因子。ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑存在于各種癌癥類(lèi)型中，因此正在研究作為治療干預(yù)的靶標(biāo)。

在這里，我們描述了如何在Operetta CLS高內(nèi)涵分析系統(tǒng)上自動(dòng)化研究ERK信號(hào)傳導(dǎo)的活細(xì)胞FRET測(cè)定。該測(cè)定可以用于藥物發(fā)現(xiàn)。

基于FRET的ERK生物傳感器

FRET是從供體分子到受體分子的非輻射能量轉(zhuǎn)移。能量轉(zhuǎn)移需要供體和受體間隔小于10nm，因此提供了研究分子接近度變化的敏感工具，例如蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用（分子間FRET）或蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化（分子內(nèi)FRET）。在這項(xiàng)研究中，我們專(zhuān)注于分子內(nèi)FRET，使用稱(chēng)為EKAREV的CFP-YFP生物傳感器（圖2）。穩(wěn)定表達(dá)EKAREV的細(xì)胞由Somponnat Sampattavanich博士友情提供（圖3）。在該生物傳感器中，供體和受體熒光團(tuán)以單一融合蛋白編碼。EKAREV生物傳感器經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可以減少隨機(jī)觸發(fā)的基礎(chǔ)FRET信號(hào)，并使其可靠地與距離相關(guān)。ERK對(duì)EKAREV的磷酸化觸發(fā)構(gòu)象變化，使CFP和YFP靠近誘導(dǎo)FRET。

圖2.細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶活性報(bào)告基因（EKAREV）的示意圖。在該生物傳感器中，兩種熒光蛋白通過(guò)ERK底物結(jié)構(gòu)域，接頭和結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開(kāi)。一旦ERK底物結(jié)構(gòu)域經(jīng)過(guò)ERK的磷酸化，就會(huì)觸發(fā)構(gòu)象變化，使CFP和YFP緊密接近并允許FRET發(fā)生。

EKAREV生物傳感器是分子內(nèi)FRET的實(shí)例，其中供體和受體以1：1的固定化學(xué)計(jì)量存在。因此，進(jìn)行雙通道比率實(shí)驗(yàn)就足夠了，通道1檢測(cè)受體發(fā)射光(I_Acceptor)，通道2檢測(cè)供體發(fā)射光(I_Donor)，將得到的兩個(gè)熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行背景校正，并計(jì)算它們的比率以給出相對(duì)FRET效率E_FRET:

測(cè)定方法

將1.2×10₄EKAREV細(xì)胞/孔接種到CellCarrier-96Ultra微量培養(yǎng)板（PerkinElmer＃6055300），150μl培養(yǎng)基（表1）中。孵育2天后（37℃，5％CO₂），150μl饑餓培養(yǎng)基洗滌兩次并在饑餓培養(yǎng)基中孵育5小時(shí)以降低基礎(chǔ)ERK活性。另外，在孵育開(kāi)始時(shí)向細(xì)胞中加入各種濃度的抑制劑或DMSO。4.5小時(shí)后，將細(xì)胞核用4μM DRAQ5在37℃，5％CO₂下染色30分鐘。然后用饑餓培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，并加入含有8μl 20x濃縮抑制劑或DMSO對(duì)照的150μl新鮮饑餓培養(yǎng)基。作為對(duì)照，在某一時(shí)間點(diǎn)，向細(xì)胞中加入8μl20x濃縮誘導(dǎo)物（PMA或EGF）。為了抑制FRET信號(hào)，應(yīng)用PD184352，SCH772984和Ulixertinib。含有或不含有所測(cè)試化合物的高DMSO濃度的培養(yǎng)基用作對(duì)照。

試劑，化合物和介質(zhì)列表

成像

在寬場(chǎng)模式下使用20x高NA物鏡（NA 0.8）在Operetta CLS系統(tǒng)上建立長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)，獲取圖像總共97分鐘。將FRET誘導(dǎo)化合物添加到血清饑餓細(xì)胞后，開(kāi)始時(shí)間序列，測(cè)量間隔為每8分鐘一次，在此設(shè)置中獲得了四個(gè)渠道：DRAQ5 （ex 615-645，em655-760），CFP（ex 435-460，em 470-515），YFP（ex490-515，em 525-580）和FRET（ex 435-460，em 515-580）（圖3）。

圖3.穩(wěn)定表達(dá)EKAREV生物傳感器的人乳腺上皮細(xì)胞。細(xì)胞核用DRAQ5染色。隨后，在Operetta CLS系統(tǒng)上使用寬場(chǎng)模式的20x高NA物鏡對(duì)細(xì)胞成像。

分析策略

使用Harmony®高內(nèi)涵成像和分析軟件進(jìn)行自動(dòng)圖像分析。簡(jiǎn)言之，將圖像分割成細(xì)胞和背景。計(jì)算細(xì)胞質(zhì)和背景中的供體和FRET強(qiáng)度，然后計(jì)算背景校正的FRET比率作為終結(jié)果（圖4）。

圖4.使用Harmony軟件進(jìn)行比率FRET定量的圖像分析工作流程：細(xì)胞和背景的細(xì)胞質(zhì)被分段，低表達(dá)細(xì)胞被強(qiáng)度閾值排除。量化供體和FRET通道的強(qiáng)度及其適當(dāng)?shù)谋尘?，并?jì)算背景校正的FRET強(qiáng)度比。減去背景強(qiáng)度在活細(xì)胞應(yīng)用中尤其有利，其中具有自發(fā)熒光組分的培養(yǎng)基通常導(dǎo)致更高的背景并因此導(dǎo)致更小的測(cè)定窗口。

結(jié)果

為了探索是否可以使用基于FRET的生物傳感器在Operetta CLS上研究ERK信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，用不同的ERK和MEK激活劑和抑制劑處理EKAREV細(xì)胞。（圖5）。

圖5.外源添加的活化劑（綠色）和抑制劑（紅色）示意圖及其對(duì)ERK信號(hào)通路的影響。表達(dá)EKAREV的細(xì)胞用EGF或PMA處理以誘導(dǎo)ERK活化，另外，用三種MEK和ERK特異性抑制劑（PD184352，SCH772984，Ulixertinib），在途徑的不同位置中斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

PMA和EGF充當(dāng)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)的特異性激活劑。EGF特異性結(jié)合細(xì)胞表面上的EGF受體，而PMA作為親脂性，膜可滲透的分子通過(guò)直接激活RAF激活該途徑。PD184352可以通過(guò)選擇性抑制MEK1/2來(lái)抑制ERK途徑，而Ulixertinib和SCH772984都是ERK1/2的有效和選擇性抑制劑。

首先，為了更多地了解FRET誘導(dǎo)和抑制的動(dòng)態(tài)性質(zhì)，記錄了97分鐘的長(zhǎng)時(shí)實(shí)驗(yàn)。正如所料，與未處理的對(duì)照相比，單獨(dú)用EGF或PMA處理細(xì)胞導(dǎo)致FRET比率的強(qiáng)烈增加（圖6）。大約30分鐘后信號(hào)處于高位。對(duì)照顯示較低水平的ERK活化，并且觀察到隨時(shí)間穩(wěn)定增加。由于ERK1/2可以通過(guò)多種生長(zhǎng)因子和有絲分裂來(lái)調(diào)節(jié)，這可能是由活細(xì)胞成像過(guò)程中的自分泌或旁分泌信號(hào)引起的。用不同濃度的ERK抑制劑（SCH772984）共同處理細(xì)胞導(dǎo)致ERK反應(yīng)的劑量依賴(lài)性降低。在5μMSCH772984中，通過(guò)EGF的ERK活化幾乎可以忽略不計(jì)，表明在該濃度下ERK被*抑制。請(qǐng)注意，0.5％DMSO是實(shí)驗(yàn)中使用的高濃度，確實(shí)對(duì)FRET比率有影響，因此需要包括此對(duì)照。用第二種ERK1/2特異性抑制劑Ulixertinib獲得了類(lèi)似的結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖6.在Operetta CLS系統(tǒng)上使用基于EKAREV FRET的生物傳感器的ERK信號(hào)傳導(dǎo)的時(shí)間進(jìn)程。通過(guò)EGF或PMA刺激ERK誘導(dǎo)快速FRET信號(hào)增加，在約30分鐘后平穩(wěn)。高濃度的SCH772984（5μM）導(dǎo)致幾乎*抑制ERK活化（1μg/ ml EGF），沒(méi)有可測(cè)量的FRET信號(hào)增加。較高稀釋度的SCH772984僅部分抑制EGF誘導(dǎo)的ERK活化。control顯示沒(méi)有任何處理的樣品有中間輕微上升的FRET信號(hào)。0.5％DMSO略微抑制FRET信號(hào)，這是實(shí)驗(yàn)中使用的DMSO的高濃度。測(cè)定統(tǒng)計(jì)：Z'= 0.87（在時(shí)間點(diǎn)32分鐘計(jì)算，DMSO為陰性，EGF為陽(yáng)性對(duì)照）

當(dāng)FRET信號(hào)在32分鐘后達(dá)到恒定水平時(shí)，選擇該時(shí)間點(diǎn)以確定SCH772984的IC50值。用1μg/ mL EGF和系列稀釋的SCH772984處理EKAREV細(xì)胞，稀釋范圍為10pM至3μM。計(jì)算的IC50值為272nM的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)如圖7所示。

圖7.ERK抑制劑SCH772984導(dǎo)致基于FRET的EKAREV信號(hào)的劑量依賴(lài)性降低。在1μg/ ml EGF存在下，用遞增濃度的SCH772984處理EKAREV細(xì)胞。在孵育32分鐘后，在Operetta CLS系統(tǒng)上測(cè)定FRET比率，因?yàn)樾盘?hào)在此時(shí)間點(diǎn)穩(wěn)定。高Z'值（Z'= 0.89）顯示出優(yōu)異的分析性能。

為了研究EKAREV FRET成像測(cè)定是否可用于研究直接作用于MEK1/2的途徑調(diào)節(jié)，測(cè)試了MEK1/2抑制劑PD184352對(duì)PMA化細(xì)胞的作用（圖8）。如圖所示，PD184352抑制PMA誘導(dǎo)的ERK活化。

圖8.在Operetta CLS系統(tǒng)上測(cè)量的PD184352對(duì)PMA活化的Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)的抑制。EKAREV細(xì)胞用另一組活化劑和抑制劑（PMA+PD184352）處理，其作用在RAF/MEK的上游（與圖5比較）。用200或2000nM PMA處理的EKAREV細(xì)胞顯示出高FRET反應(yīng)（誘導(dǎo)后32分鐘）。通過(guò)將細(xì)胞與MEK1/2特異性抑制劑PD184352以10μM的濃度共孵育來(lái)抑制活化。

結(jié)論

EKAREV FRET生物傳感器可用于Operetta CLS系統(tǒng)的活細(xì)胞成像測(cè)定，以研究ERK的激活和抑制。級(jí)聯(lián)內(nèi)不同靶標(biāo)的調(diào)節(jié)很容易測(cè)量，因此這種方法可以有助于鑒定干擾Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)的新化合物。該測(cè)定在活細(xì)胞中進(jìn)行，因此它可用于分析ERK信號(hào)傳導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，而定量ERK磷酸化的常規(guī)生物化學(xué)技術(shù)通常是終點(diǎn)測(cè)定。盡管細(xì)胞群中生物傳感器表達(dá)水平相對(duì)不均勻（圖3），但FRET比率的計(jì)算提供了特別好的化驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，Z'值高于0.87。

EKAREV生物傳感器的優(yōu)化設(shè)計(jì)，Operetta CLS系統(tǒng)的高質(zhì)量成像以及Harmony內(nèi)圖像分析的出色工具都有助于提高這里提供的高含量FRET分析的穩(wěn)定性。Harmony軟件的構(gòu)建模塊概念允許創(chuàng)建易于設(shè)置和理解的圖像分析序列，并且不需要專(zhuān)業(yè)的圖像分析知識(shí)。該測(cè)定還提供了Opera Phenix™高含量篩選系統(tǒng)的可比較結(jié)果和測(cè)定統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。由于Operetta CLS和Opera Phenix系統(tǒng)比傳統(tǒng)顯微鏡具有更高的通量，基于FRET的生物傳感器的高含量成像為藥物發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的基礎(chǔ)研究開(kāi)辟了新的可能性。

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