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Real-time PCR技術(shù)

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一.    樣品的RNA抽提(Trizol,Invitrogen)
 

1、樣本處理

1)培養(yǎng)細(xì)胞:收獲細(xì)胞 1-5×10 7 ,移入 1.5ml 離心管中,加入 1ml Trizol ,混勻,室溫靜置 5min。

2)組織:每50 - 100mg組織樣品,用液氮研磨成粉末,加入1 ml的TRIZOL試劑,混勻,室溫靜置 5min。

 

2、兩相分離

每1 ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2 ml的氯仿,蓋緊管蓋,劇烈振蕩管體,室溫靜置 5min。4°C下12,000 ×g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的體積大約使勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

 

3、RNA沉淀

將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA,加入異丙醇的量為每個樣品勻漿時加入1 ml TRIZOL試劑的此時加0.5 ml的異丙醇?;靹蚝?5到30°C孵育10分鐘后,于4°C 12,000 ×g離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

 

4、RNA清洗

移去上清液,每1 ml TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇,清洗RNA沉淀。振蕩后,4°C 7,500 ×g離心5分鐘。

 

5、重新溶解RNA沉淀

去除乙醇溶液,空氣中干燥RNA沉淀5 - 10分鐘,切勿真空離心干燥。注意RNA沉淀不要*干燥,否則將大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA樣品A260 / 280比值將小于1.6。溶解RNA時,先加入無RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾次,然后55到60°C孵育10分鐘。獲得的RNA溶液保存于- 70°C。

 

二.    RNA濃度與純度測定

取1μlRNA樣品稀釋100倍后測定RNA濃度及OD260、OD280。純的RNAOD260/280在1.8~2.0之間。樣品RNA濃度計算公式為:A260 X 稀釋倍數(shù)×40 ng/ul。

 

三.    RT(PrimeScript® RT reagent Kit  Perfect Real Time,Takara)

1、按下列組份配制RT反應(yīng)液

 

5×PrimeScript Buffer

2 μl

PrimeScript® RT Enzyme Mix I

0.5μl

Oligo dT Primer(50 μM)*1

0.5μl

Random 6 mers(100 μM)*1

0.5μl

Total RNA

0.5ng

RNase Free dH2O

Up to 10μl

2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15 min,85℃ 5 sec。

3、反應(yīng)結(jié)束后,將其放在冰上待用或-20℃保存。

 

四.    qPCR(SYBR Premix Ex Taq,Takara)

1、按下列組份分別配制Realtime PCR反應(yīng)體系。

 

SYBR Premix Ex Taq

12.5 μl

PCR Forward Primer(10 μM)

0.5 μl

PCR Reverse Primer(10 μM

0.5 μl

DNA模板

1.0 μl

dH2O(滅菌蒸餾水

10.5 μl

Total

25μl

輕彈管底將溶液混合,5000 rpm短暫離心。

2、步驟1配置的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。

95℃,5min;40個PCR循環(huán)(95℃,10秒;60℃,20秒;72℃,20秒;79℃,20秒(收集熒光))。

為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線,擴增反應(yīng)結(jié)束后,(95℃,2min;60℃,20秒;72℃,20秒;99℃,15秒,并從72℃緩慢加熱到99℃(8分鐘)。

3、結(jié)果與計算

各樣品的目的mRNA和內(nèi)參(GAPDH)分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2 - △△ CT法進(jìn)行分析

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