Glycated hemoglobin A1c ELISA KIT(ELISA試劑盒)樣品收集、處理及保存方法:血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。檢測對象:人血清/血漿及相關(guān)液體實驗方法:雙抗原夾心法進行測
Glycated hemoglobin A1c ELISA KIT(ELISA試劑盒)
Glycated hemoglobin A1c ELISA KIT 即糖化血紅蛋白 A1c 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒,以下是關(guān)于它的詳細介紹:
雙抗體夾心法:以兔糖化血紅蛋白 A1c ELISA 試劑盒為例,用純化的糖化血紅蛋白 A1c 抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入糖化血紅蛋白 A1c,再與 HRP 標記的糖化血紅蛋白 A1c 抗體結(jié)合,形成抗體 - 抗原 - 酶標抗體復合物,經(jīng)過che底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的糖化血紅蛋白 A1c 呈正相關(guān),用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度(OD 值),通過標準曲線計算樣品中糖化血紅蛋白 A1c 濃度。
競爭法:如 Abbexa 公司的人糖化血紅蛋白 A1c ELISA 試劑盒,是基于競爭酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)。先將抗體預包被到 96 孔板上,加入標準品、測試樣品和生*素標記的試劑,生*素標記的糖化血紅蛋白 A1c 和未標記的糖化血紅蛋白 A1c 會在包被抗體上發(fā)生競爭抑制反應,再加入 HRP 標記的試劑,孵育后洗去未結(jié)合的結(jié)合物,加入 TMB 底物進行顯色,顏色變化與糖化血紅蛋白 A1c 的量成反比,通過測定 OD 值計算糖化血紅蛋白 A1c 的濃度。
酶標包被板:通常為 96 孔或 48 孔板,表面預包被有特異性抗體。
標準品:已知濃度的糖化血紅蛋白 A1c,用于制作標準曲線,以便根據(jù)樣品的吸光度值計算其濃度。
酶標試劑:一般為 HRP 標記的抗體或其他酶標記的試劑,用于與抗原或抗體結(jié)合,產(chǎn)生可檢測的信號。
顯色劑:如 TMB 底物,在酶的作用下發(fā)生顏色變化,用于指示反應的結(jié)果。
終止液:用于終止顯色反應,使顏色穩(wěn)定,便于測量吸光度。
洗滌液:用于洗滌反應板,去除未結(jié)合的物質(zhì),減少非特異性結(jié)合的干擾。
樣品稀釋液:用于稀釋樣品,使樣品中的糖化血紅蛋白 A1c 濃度在試劑盒的檢測范圍內(nèi)。
以常見的雙抗體夾心法為例:
試劑準備:將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出,在室溫平衡 15-30 分鐘。按照說明書要求稀釋洗滌液、配制酶標工作液等。
加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上準確加入標準品和待測樣品,加樣時將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育一定時間,使抗原與抗體充分結(jié)合。
洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后棄去,如此重復多次,拍干,以去除未結(jié)合的物質(zhì)。
加酶:每孔加入酶標試劑,空白孔除外,然后進行溫育。
顯色:每孔先加入顯色劑 A,再加入顯色劑 B,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色一定時間。
終止:每孔加終止液,終止反應,此時顏色會發(fā)生變化,如藍色立轉(zhuǎn)黃色。
測定:以空白孔調(diào)零,在 450nm 波長下依序測量各孔的吸光度(OD 值),并根據(jù)標準曲線計算樣品中糖化血紅蛋白 A1c 的濃度。
試劑盒保存:應按照說明書要求在 2-8℃條件下保存,避免冷凍和反復凍融,有效期一般為 6 個月左右。
操作規(guī)范:嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育,所有試劑在使用前需達到室溫 20-25℃。加樣要準確,使用加樣器并經(jīng)常校對其準確性,一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)。
避免污染:操作過程中要注意防止交叉污染,封板膜只限一次性使用,不同批號的試劑組分不得混用。
底物保存:底物顯色液應避光保存,如發(fā)現(xiàn)底物液已經(jīng)變藍則不能使用。