1. SD大鼠，250g，通過頸椎脫位處死大鼠，浸入75%乙醇浸泡5分鐘，轉(zhuǎn)移到通風(fēng)柜中的解剖盤中。

2. 打開皮膚，暴露、收集股骨，無菌狀態(tài)下移除附著的肌肉和組織。

3. 并轉(zhuǎn)移股骨至預(yù)冷含雙抗的PBS中，洗滌三次。冰上操作。

4. 切斷股骨骨骺， 使用5mlPBS，1ml注射器針頭沖洗，沖洗液由棕色變成粉紅色即可（股骨變白）。沖洗后，用1ml注射器吹打3-5次。

5. 70um濾網(wǎng)過濾，棄去篩網(wǎng)。使用 15ml 離心管，先加入分離液，然后緩慢加入濾過的懸液。20℃環(huán)境下，600g 離心 25min。

6. 離心后，離心管中液體由上至下分為四層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

7. 小心吸取離心管中的，環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入 5-10ml 洗滌液，混勻細(xì)胞。400g，離心 10min。

8. 棄去上清，用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細(xì)胞。 250g，離心 10min，棄去上清。 再用M199完丨全培養(yǎng)基（含10 ng/mL VEGF，1 ng/mL b-FGF，1 ng/mL EGF，20%胎牛血清、1%雙抗）清洗一次，棄去上清，M199完丨全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。250g，離心 10min，棄去上清。M199完丨全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

9. 按3×10⁶/孔種入纖連蛋白包被過的24孔板，每3天換一次培養(yǎng)基，以去除非貼壁細(xì)胞，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周。