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沙丁胺醇檢測試劑盒

來源:上海一基實業(yè)有限公司   2016年08月10日 09:27  

沙丁胺醇檢測試劑盒使用說明書

(酶聯(lián)免疫法)

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣、組織、飼料等樣本中的沙丁胺醇(SalbutamolSAL),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的沙丁胺醇和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗沙丁胺醇抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含沙丁胺醇含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中沙丁胺醇的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度:0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式:25℃,30min~15min

2.3 檢測下限:

尿液、組織………………………0.1ppb

飼料………………………………1ppb

2.4 交叉反應(yīng)率:

沙丁胺醇…………………………100%

鹽酸多巴酚丁胺…………………7.2%

西馬特羅…………………………0.1%

克倫特羅…………………………3.6%

萊克多巴胺………………………0.1% 

腎上腺素…………………………0.1%

異丙腎上腺素……………………<1%

 2.5 樣本回收率:

尿樣……………………………………90%±10% 

組織……………………………………80%±10% 

飼料……………………………………80%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液:各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):100ppb………1ml

酶標(biāo)記物(紅蓋)…………………5.5ml

抗體工作液(藍(lán)蓋)………………5.5ml

底物液A(白蓋)……………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………6ml

終止液(黃蓋)………………………6ml

20X濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml

10X復(fù)溶液(黃蓋)………………50ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2 微量移液器:單道20µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑:氫氧化鈉、乙酸乙酯、濃HCl、乙腈、異丙醇、正己烷、無水硫酸鈉 

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知:

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液:

配液1:1M鹽酸溶液

    稱取8.6ml濃HCl加去離子水至100ml。

配液2:1M NaOH 溶液

    稱取4g NaOH加去離子水至100ml。

配液3:復(fù)溶液

    將10×復(fù)溶液用去離子水10倍稀釋,用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

5.3 樣本前處理步驟:

5.3.1 尿樣本處理方法

    直接取50µl清亮尿樣進(jìn)行測定(渾濁尿樣需要過濾或經(jīng)4000r/min離心5min,以得到清亮尿樣),暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

    尿樣本稀釋倍數(shù):1    檢測下限:0.1ppb

5.3.2 組織樣本處理方法一:

   稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ,加入6ml復(fù)溶液,充分振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高,可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。取50µl上清液進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù):4    檢測下限:0.4ppb

5.3.3 組織樣本處理方法二:

1) 稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ,加入1ml復(fù)溶液,振蕩混勻后加入4ml乙腈,振蕩混勻后加入1ml異丙醇,充分振蕩5min,室溫4000r/min以上離心10min;

2) 取上清液3ml,加入50ul 1M NaOH,加入7ml乙酸乙酯,充分振蕩5min,室溫4000r/min以上離心10min,取全部上清在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥;

3) 加入1ml 復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,加入1ml正己烷混合30s ;15℃ 4000轉(zhuǎn)/分 以上離心5min。

4) 取50µl下層液進(jìn)行分析。

組織樣本稀釋倍數(shù):1    檢測下限:0.1ppb

5.3.4 飼料樣本處理方法:

1)稱取均質(zhì)后的飼料樣品1.0±0.05g,加入10ml甲醇,再加入5g無水硫酸鈉,振蕩2min;室溫 4000r/min以上離心10min;

2)吸出離心后的上清液1ml,于56℃氮氣吹干,用1 ml復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,再加入1mL正己烷混合30s;室溫4000r/min以上離心5min。

3)取50µl下層進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù):10    檢測下限:1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。

實驗開始前,用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌:小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次,每次間隔30秒,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

6.4 顯    色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以*個標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即

 

 百分吸光度值(%)=

A

×100%

A0

 

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(索?。?/span>

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫(25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻,洗板要*,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒,不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位(A450nm< 0.5 )時,表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件:試劑盒于2-8℃保存,避免冷凍。

保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

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