內(nèi)毒素

內(nèi)毒素致病性

Pfeiffer于十九世紀首先提出“內(nèi)毒素”一詞，研究表明，內(nèi)毒素在機體內(nèi)作用于單核巨噬細胞產(chǎn)生多種細胞因子（腫瘤壞死因子TNF，白細胞介素IL，干擾素Interferon，凝血素等）。當(dāng)這些因子在機體內(nèi)過量時，則可導(dǎo)致機體出現(xiàn)發(fā)熱、低血壓、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。

因此，人和動物的注射藥物、生物制品和醫(yī)療器械的終端產(chǎn)品中的內(nèi)毒素的檢測和去除顯得尤為重要。

內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的一部分，其主要成分為脂多糖（LPS），經(jīng)細菌細胞裂解后釋放出來。LPS可以分為三個不同的結(jié)構(gòu)域：特異性O(shè)鏈、核心寡聚糖和類脂A，如下圖所示：

內(nèi)毒素特性

• 性質(zhì)穩(wěn)定：160℃的溫度下加熱2-4個小時，或用強堿、強酸或強氧化劑加熱煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。
• 經(jīng)甲醛溶液處理后，可降低其毒性，但不能成為類毒素。

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  中國藥典（CP）規(guī)定，藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：

  L=K/M

   

  式中L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示；

  K為人每公斤體重每小時zui大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg• h)表示，注射劑K=5 EU/(kg• h)，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg• h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg• h)；

  M為人用每公斤體重每小時zui大劑量，以ml (kg• h)、mg(kg• h)或U/(kg• h)表示，人均體重按60 kg計算，人體表面積按1.62 m2計算，注射時間若不足1小時，按1小時計算。

  按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。

   

  美國藥典（USP）規(guī)定，非經(jīng)腸道藥品的內(nèi)毒素限值，以劑量定義，等于：K/M。

  除了鞘內(nèi)給藥以外的任何給藥途徑，K均為5 USP-EU/kg，鞘內(nèi)給藥時，K為0.2 USP-EU/kg，對于非鞘內(nèi)給藥放射性藥品，內(nèi)毒素限值的計算為175/V，V為以ml為單位的zui大推薦劑量，對于鞘內(nèi)給藥的放射性藥品，其內(nèi)毒素限值為14/V，對于按以每平方體表面積計算的給藥劑量（通常是抗腫瘤藥品），計算公式為K/M，其中K=5 EU/kg，M為(zui大劑量/m2/小時×1.80m2)/70kg。

  檢測方法的建立：

  1968年，由Leivin和Bang發(fā)現(xiàn)并建立了利用鱟試劑檢測細菌內(nèi)毒素的方法。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)遇到內(nèi)毒素時，鱟的血液能夠凝結(jié)成塊。用鱟血液中的變形細胞提取物與待檢樣品混合，如果待檢樣品中含有內(nèi)毒素，則會觀察到上述情況。鱟試驗法（LT）已經(jīng)替代了熱原檢查家兔法檢驗藥品中的內(nèi)毒素。

  目前FDA已經(jīng)批準了以下LAL檢測法：凝膠法（ToxinSensorTM凝膠法內(nèi)毒素檢測試劑盒）、濁度法和顯色法（ToxinSensorTM顯色法LAL內(nèi)毒素檢測試劑盒）。

   

  LAL檢測方法原理圖

   

  

   

  半定量測定——凝膠法

  通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來半定量內(nèi)毒素的方法，是各國藥典細菌內(nèi)毒素檢查的方法。

  定量測定——濁度法和顯色法

  濁度法（動態(tài)濁度法和終點濁度法）是通過鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化來測定內(nèi)毒素含量的方法。終點濁度法是基于細菌內(nèi)毒素濃度和反應(yīng)混合物的終點濁度( 吸收度或透光率) 之間的定量關(guān)系的一種檢測方法；動態(tài)濁度法（又稱動態(tài)比濁法）是檢測反應(yīng)混合物的濁度上升某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時間，或是檢測濁度增加速度的方法。

  顯色法（動態(tài)顯色法和終點顯色法）是將鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)，可使特定底物顯色，通過釋放出的呈色團的多少來測定內(nèi)毒素含量，又稱為比色法。終點顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動態(tài)顯色法是檢測反應(yīng)混合物的色度達到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時間, 或檢測色度增長速度的方法。

   

  內(nèi)毒素檢測方法的選擇：

  凝膠法——僅需檢測樣品的內(nèi)毒素*。此法操作比較簡單、經(jīng)濟，不需要測定設(shè)備，可進行定性或半定量測定。

  顯色法（或濁度法）——定量測定樣品中內(nèi)毒素含量。

• 日常檢測量不大時，可以選擇終點顯色法，用普通的分光光度計就可完成實驗。
• 檢測的樣品是生物制品、疫苗、血液制品等選用終點顯色法或動態(tài)顯色法。
• 檢測量比較大，檢測的樣品對鱟試劑的干擾不大，可選用動態(tài)濁度法鱟試劑。

• 注：動態(tài)濁度法與動態(tài)顯色法需要帶溫育系統(tǒng)的動態(tài)光度測定儀器及配套軟件。