液相色譜（High Performance Liquid Chromatography）是近年來發(fā)展起來的一種具有高靈敏度、高選擇性的快速分離分析技術。它既能用于微量組分的分析測定，又能用于大量的制備分離，靈活多樣。液相色譜在使用過程中常會出現(xiàn)一些影響分析結果的問題，如果了解一些日常使用和維護注意事項，就能做到早預防、勤維護，使分析結果保持較好的穩(wěn)定性與較高的性。 

　　一、流動相 

　　1.流動相的性質要求 

　　液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下特點： 

　　1.1流動相應不改變填料的性質。 

　　1.2純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，溶劑所含雜質在柱上積累，影響色譜柱的使用壽命。流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質和其他物質（使用0.45um或更細的膜過濾）。 

　　1.3流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。比如使用紫外檢測器時，所用的流動相在檢測波長下應沒有吸收或吸收很小，溶劑中如果有吸收紫外光的物質，會使檢測背景提高，靈敏度降低，且用作梯度洗脫時會引起嚴重漂移。。 

　　1.4對樣品的溶解度要適宜。流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。 

　　1.5流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實驗無法進行。 

　　2.流動相的PH值 

　　流動相的pH 值應控制在2～8 之間。當pH 值大于8 時，可使載體硅膠溶解；當pH 值小于2 時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。 

　　3.流動相的脫氣 

　　HPLC所用的流動相必須預先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相反應，一般采用超聲脫氣。 

　　4.流動相的過濾 

　　所用溶劑使用前必須經(jīng)0.45um濾膜濾過，以除去雜質微粒。用濾膜過濾時，注意分清有機相和水相濾膜。且勿混用，有機相濾膜過水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜過有機溶劑時，濾膜會被溶解。嚴禁溶有濾膜的溶劑用于液相色譜分析中。 

　　5.流動相的貯存 

　　流動相一般貯存于玻璃或不銹鋼容器內，不能貯存于塑料容器內。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器內一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化。也防氧和二氧化碳溶入溶劑。應盡量新鮮配制使用，不要貯存。 

　　6.實驗用水 

　　實驗用水應為超純水，并通過濾膜過濾。 

　　二、色譜柱 

　　液相色譜法對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。所以說色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，要注意下列問題，以維護色譜柱。 

　　1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況。因此在安裝時要輕拿輕放。 

　　2.色譜柱的使用方向 色譜柱所示方向是評價流動相流動方向。不可以反沖會迅速降低柱效。 

　　3.色譜柱PH使用范圍是2.0-9.0。當使用PH值范圍邊界時，分析結束立即用與所使用流動相互溶的溶劑*清洗置換流動相。 

　　4.避免將基質復雜的樣品尤其生物樣品直接注入柱內，是用預處理柱。 

　　5.每次分析結束后，都要對色譜柱進行沖洗。每次工作完后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。 

　　6.若長時間不用該色譜柱，要沖洗好后，用純甲醇或乙腈封存。 

　　三、泵的使用和維護注意事項 

　　為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，應按以下注意事項進行操作： 

　　1.防止任何固體微粒進入泵體，因為塵?；蚱渌魏坞s質微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)等，泵的入口應經(jīng)常清洗或更換。 

　　2.流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內。尤其是在停泵過長時間情況下。由于溶液靜置，就可能析出鹽的微細晶體。同樣會損壞密封環(huán)、柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗。再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑。 

　　3.要防止溶劑瓶內的流動相用完，空泵運轉會磨損柱塞或密封環(huán)，zui終產(chǎn)生漏液。 

　　4.壓力不要超過規(guī)定的zui高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形漏液。 

　　5.流動相應先脫氣，以免在泵內產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量的氣泡，泵就無法正常工作。 

　　四、檢測器的維護 

　　作為液相色譜儀的三大關鍵部件（輸液泵、色譜柱、檢測器）之一的檢測器，主要用于監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度的變化，將樣品組成和含量變化轉化為可供檢測的信號，完成定性、定量分析。常用的檢測器主要有紫外檢測器、熒光檢測器等。 

　　1.紫外檢測器 

　　使用紫外檢測器時要注意環(huán)境因素帶來的干擾由于靜電的作用，檢測器在使用時易于從周圍環(huán)境中吸附塵埃，覆蓋在光學元件上的塵埃能降低光的傳播效率，加大了光的散射，對檢測有影響。故紫外檢測器周圍的環(huán)境要清潔，經(jīng)常打掃，保持干凈。強紫外照射還會使一些光學材料涂層降解，慢慢增加噪聲，故檢測器應避免陽光直射。長時間不用檢測器時，應定期沖洗流路趕走池內產(chǎn)生的氣泡。 

　　2.熒光檢測器的使用與維護 

　　熒光檢測器的靈敏度比紫外檢測器高，特別適用于痕量組分檢測。日常使用中應注意以下幾點： 

　　2.1不能使用抑制或吸收熒光的溶劑作流動相仁。 

　　2.2溶劑的極性和溶液的溫度對熒光強度有明顯的影響。增大溶劑的極性，導致熒光增強。通常熒光物質溶液的熒光效率和熒光強度，隨著溫度的升高而降低，液相色譜中，熒光檢測器通常在室溫下操作，可以保證足夠的靈敏度。 

　　2.3當樣品濃度過高時，熒光物質分子易與溶劑分子或其它溶質分子相互作用，引起溶液的熒光強度降低，熒光強度不再與濃度呈線性關系，即熒光淬滅效應。因此，在進行熒光檢測時，試樣要配成低于10-6g/mL濃度的溶液，要使用不含熒光物質的溶劑。 

　　液相色譜儀正以它分辨率高、分析速度快和應用廣泛的優(yōu)點倍受儀器分析工作者的青睞，廣泛地應用于生物醫(yī)藥研究、環(huán)境監(jiān)測和食品檢測等領域。我們在工作中，為保證分析結果的科學性和準確性，必須重視和加強對液相色譜儀的管理和維護。只有良好規(guī)范的管理，才能使儀器處于*工作狀態(tài)，保證各項分析工作順利完成，得出的實驗數(shù)據(jù)真實可靠。