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細(xì)胞培養(yǎng)液(二)

來(lái)源:上海希言科學(xué)儀器有限公司   2017年11月30日 17:29  

第四節(jié) 合成細(xì)胞培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分,用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方,是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達(dá)10多余種,有的培養(yǎng)基仍在不斷進(jìn)行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基,目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的商品,從zui初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基,并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。

一、基本組分 基本培養(yǎng)基包括四大類(lèi)物質(zhì):無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

無(wú)機(jī)鹽:CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。

氨基酸:纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料,不能由其他氨基酸或糖類(lèi)轉(zhuǎn)化合成。除此之外,還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用,對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)特別重要,能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜;它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來(lái)源,還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì),谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是:谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,故4℃下放置1周可分解50%,使用中單獨(dú)配制,置-20℃冰箱中保存,用前加入培養(yǎng)液中。

維生素:是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生物活性物質(zhì),在細(xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶,對(duì)細(xì)胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補(bǔ)充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是*的,對(duì)具有合成膠原能力的細(xì)胞更為重要。

碳水化合物:是細(xì)胞生命的能量來(lái)源,有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí),幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用:乳酸是葡萄糖不*氧化的產(chǎn)物。研究表明,體外培養(yǎng)條件下95%的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?,這降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率,降低培養(yǎng)基pH值,增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下,NADH轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+,細(xì)胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應(yīng)生產(chǎn)乳酸和NAD+,從而保證了糖酵解的順利進(jìn)行。另一個(gè)可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下,直接導(dǎo)致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下,葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解,產(chǎn)生過(guò)量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)zui常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量,但葡萄糖含量過(guò)低可造成細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。該方法需要對(duì)葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達(dá)量等參數(shù)進(jìn)行綜合考慮方可應(yīng)用。

在目前常用的培養(yǎng)基中,葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的主要能源,其能量代謝通路與體內(nèi)*不同,表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細(xì)胞提供能量,谷胺酰胺大部分通過(guò)不*氧化途徑,另一小部分通過(guò)*氧化為細(xì)胞供能。因此,適當(dāng)?shù)恼{(diào)整細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑,使之能促進(jìn)細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成,同時(shí)減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。

許多動(dòng)物細(xì)胞如CHO、BHK和雜交瘤細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)而言,二者的快速利用并非細(xì)胞必需;相反相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨,以及一些非必需氨基酸如丙氨酸,脯氨酸。其中,乳酸和氨是兩種主要代謝廢物,其積累可影響細(xì)胞生長(zhǎng)以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累,是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的重要方向。

氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。

除了以上與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的物質(zhì)以外,培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅(當(dāng)溶液酸性時(shí)pH小于6.8呈黃色;當(dāng)溶液堿性時(shí)pH大于8.4呈紅色),一種pH指示劑。

在較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類(lèi))以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。

二、常用細(xì)胞培養(yǎng)基

(1)MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列(參看本-產(chǎn)品展示)

(2)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列(參看本-產(chǎn)品展示)

(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列(參看本-產(chǎn)品展示)

(4)199細(xì)胞培養(yǎng)基系列(參看本-產(chǎn)品展示)

(5)水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基(參看本-產(chǎn)品展示)

(6)歐氏平衡鹽(參看本-產(chǎn)品展示)

(7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列(參看本-產(chǎn)品展示)

(8)其它類(lèi)型細(xì)胞培養(yǎng)基 

三、干粉培養(yǎng)基的配制

配制培養(yǎng)基要注意以下問(wèn)題:

認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)都注明干粉不包含的成分,常見(jiàn)的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的,如NaHCO3、谷氨酰胺,有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。

配制是要保證充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基*溶解之后才能添加。

配制所用的水應(yīng)是三蒸水,離子濃度很低。

所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。

配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾,無(wú)菌保存于4度。

液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基,它是一種滅菌后保證無(wú)菌的溶液,必要時(shí)可制成無(wú)內(nèi)毒素等的溶液,可節(jié)省科研人員的工作量。

配制方法

在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5%的雙蒸水。

在室溫(20℃到30℃)的水中加入干粉培養(yǎng)基,輕輕攪拌,不要加熱。

水洗包裝袋的內(nèi)部,轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。

加NaHCO3到培養(yǎng)基中。

用雙蒸水稀釋到想要的體積,攪拌溶解。注意不要過(guò)分?jǐn)嚢琛?/p>

通過(guò)緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調(diào)節(jié)pH值,由于pH值在過(guò)濾時(shí)會(huì)上升0.1到0.3,因而調(diào)節(jié)pH值使它比zui終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過(guò)濾前要保持密封。

第五節(jié) 無(wú)血清技術(shù)及其培養(yǎng)基

經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后,無(wú)血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢(shì)。采用無(wú)血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本,簡(jiǎn)化分離純化步驟,避免病毒污染造成的危害。

無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求,但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合,如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用,這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子;又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌某種物質(zhì)(抗體、生長(zhǎng)因子)的能力;或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞,以獲得它們的分泌產(chǎn)物。因此研制出無(wú)血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。上海恒利安生物科技有限公司已成功開(kāi)發(fā)了商業(yè)化的多種無(wú)血清培養(yǎng)基,可滿足眾多廠商的需求。

一、無(wú)血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。

用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí),多數(shù)呈貼壁生長(zhǎng)或兼性貼壁生長(zhǎng);而當(dāng)其在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白,細(xì)胞往往以懸浮形式生長(zhǎng)。 

添加組分包括以下幾大類(lèi)物質(zhì):

(1)促貼壁物質(zhì):許多細(xì)胞必須貼壁才能生長(zhǎng),這種情況下無(wú)血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子,一般為細(xì)胞外基質(zhì),如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子,對(duì)許多細(xì)胞的繁殖和分化,起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化,這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。

(2)促生長(zhǎng)因子及激素:針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長(zhǎng)因子。激素也是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì),有些激素是許多細(xì)胞*的,如胰島素。

(3)酶抑制劑:培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,需要用胰酶消化傳代,在無(wú)血清培養(yǎng)基中*須含酶抑制劑,以終止酶的消化作用,達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。zui常用的是大豆胰酶;抑制劑。

(4)結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:常見(jiàn)如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大,可增加培養(yǎng)基的粘度,保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

(5)微量元素:硒是zui常見(jiàn)的。

二、使用方法:目前,血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中zui基本的的添加物,尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí),常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以后,再換成無(wú)血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程,一般要逐步降低血清濃度,從10%減少到5%,3%,1%,直至無(wú)血清培養(yǎng)。在降低過(guò)程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化,是否有部分細(xì)胞死亡,存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留,很少有細(xì)胞能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)之前,要留有種子細(xì)胞,種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中,以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng),關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞:

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期

>90% 活細(xì)胞率

適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種

有兩種方法使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM):

1、直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中。

一些類(lèi)型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng),接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×105~3.5×105細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml時(shí),傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×106~4×106細(xì)胞/ml時(shí),細(xì)胞*適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基。每隔3~5天,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml,細(xì)胞活率在90%時(shí),貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

2、連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中,與直接適應(yīng)相比較,連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

以2倍正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基:25%SFM 混合培養(yǎng)基中,傳代培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞密度>5×105細(xì)胞/ml時(shí),以2×105到3×105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度,在有血清培養(yǎng)基:SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

以2×106到3×106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度,25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml(接種后4到6天),在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

每隔3到5天,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml,細(xì)胞活率在90%時(shí),貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物,直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應(yīng)過(guò)程中,不要讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意,與有血清培養(yǎng)基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì),因而更易于受外界因素的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清:許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng),用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1(v∶v)的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)下列的混合培養(yǎng)基的方式,連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量:1∶2,1∶4,1∶16和100%替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí),傳代細(xì)胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清,生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生,4允許進(jìn)行2到3次的傳代,使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強(qiáng)調(diào)的是:配制無(wú)血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水,如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o(wú)血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子,既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微,也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無(wú)血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。 

三、使用無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)

增加確定性

性能更加一致

容易進(jìn)行純化和下游加工

細(xì)胞功能的評(píng)估

增強(qiáng)生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量

生理反應(yīng)性的較好對(duì)照

增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測(cè)

第六節(jié) 無(wú)蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

一、無(wú)蛋白培養(yǎng)基(protein free midium,PFM):即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白,如胰島素,轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)來(lái)看,不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應(yīng)用前景,許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)zui終要應(yīng)用于人體,如果再生長(zhǎng)過(guò)程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基,純化過(guò)程就比較復(fù)雜,zui終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無(wú)蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢(shì)而出現(xiàn)的,許多無(wú)蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長(zhǎng)因子的作用。市場(chǎng)上已有適合多種細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)蛋白培養(yǎng)基。

二、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的,它同樣不含有動(dòng)物蛋白,同樣也不是添加了植物水解物,而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的CDM問(wèn)世,上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋白培養(yǎng)基就屬于CDM。

第七節(jié) 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,除了培養(yǎng)基外,還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調(diào)整液等。

一、平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS):主要是由無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖組成,它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡,保持pH穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)。主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。zui簡(jiǎn)單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個(gè)主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+,因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養(yǎng)條件,Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3,不能用于5%CO2的環(huán)境,若放入CO2培養(yǎng)相,溶液將迅速變酸,使用時(shí)應(yīng)注意。

配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+,應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過(guò)濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液:取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液,傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái),常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液和EDTA溶液,有時(shí)也用膠原酶(collagenase)溶液。

1、胰酶溶液:胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示,常見(jiàn)有1:125和1:250,即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度,配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液(如前面的D-Hank's),因?yàn)檫@些物質(zhì)會(huì)對(duì)胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的*pH是8-9,配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右,充分溶解,過(guò)濾除菌。過(guò)濾后可以再調(diào)只pH7.5,也可不調(diào)。

使用細(xì)胞清洗液配制胰酶消化液:含0.5%胰酶的細(xì)胞清洗液(100ml細(xì)胞清洗液加0.5g胰酶),過(guò)濾除菌,分裝于4度保存。

2、EDTA溶液:EDTA溶液也常用來(lái)解離細(xì)胞,它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞,還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%,配制時(shí)應(yīng)加堿助溶,配制后可過(guò)濾除菌,也可高溫消毒滅菌。

3、膠原酶溶液:膠原酶在上皮類(lèi)細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用,膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織,因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的*pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制,配制時(shí)可用PBS。 

三、pH調(diào)整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。

1、NaHCO3溶液:NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分,一般情況下按說(shuō)明書(shū)的要求準(zhǔn)確添加,以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng),即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡,所使用的培養(yǎng)基就不能按照說(shuō)明書(shū)所要求加入NaHCO3。此時(shí)常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基,使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。

2、HEPES溶液:是一種弱酸,中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下,觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境,CO2氣體迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青鏈霉素,俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效,鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液,可用PBS或培養(yǎng)基配制。

五、谷氨酰胺補(bǔ)充液:谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用,合成培養(yǎng)基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解,4℃下放置7天即可分解約50%,所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上時(shí),要重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺,故需單獨(dú)配制谷氨酰胺,以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液,即濃度為200mmol/L(29.22g/L),配制時(shí)應(yīng)加溫30℃,*溶解后過(guò)濾除菌,分裝至小瓶,儲(chǔ)存于-20℃。使用時(shí),在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液,終濃度為1~4mmol/L。

六、二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)

在細(xì)胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分;而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸,在中性的水溶液中會(huì)自發(fā)降解;需要頻繁地補(bǔ)加L-谷氨酰胺。因而在培養(yǎng)操作過(guò)程中經(jīng)常:

(1)頻繁打開(kāi)蓋子,增加了破壞無(wú)菌狀態(tài)的可能性;

(2)過(guò)多的追加L-谷氨酰胺,增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨zui少!

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞內(nèi)被氨肽酶(E.C.3.4.11.2)所水解,產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸;因此在大部分細(xì)胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是*替代物,它無(wú)需適應(yīng);既可用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng),也適合于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。

 

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