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常見組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法 (二)

來源:上海希言科學(xué)儀器有限公司   2017年12月07日 11:10  

第四節(jié) 肌組織細(xì)胞培養(yǎng)

各種肌組織均可用于培養(yǎng),以心肌和骨骼肌較實(shí)用。

(-)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)

1、出生1一2天的乳鼠,引頸處死。

2、無菌取大腿肌組織,切成0.3一0.5cm2小塊后,用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。

3、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。

4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。

5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。

接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化,明膠配置:用Hanks液配成0.01%明膠。

該細(xì)胞接種率約50%,細(xì)胞生長(zhǎng)開始呈紡錘形,培養(yǎng)50-52小時(shí)后出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止,此時(shí)可觀察到橫紋,一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。

(二)心肌細(xì)胞培養(yǎng)

心肌細(xì)胞是zui早的培養(yǎng)材料,Carrel曾長(zhǎng)期培養(yǎng)過心肌組織,至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物,zui常用的是雞胚心肌。

心肌比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng),可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法,均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好,原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形,培養(yǎng)成功時(shí),一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。

第五節(jié) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞,有多種功能,是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得,便于培養(yǎng),并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群,在條件適宜下可生活2-3周,多用做原代培養(yǎng),難以長(zhǎng)期生存。

巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系,大多來自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均獲惡性,培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能,易于傳代和瓶壁分離,但難以建株。

培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來源來獲取細(xì)胞,以小鼠腹腔取材法zui為實(shí)用,其法如下:

1、實(shí)驗(yàn)前三天,向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml(勿注入腸內(nèi)?。?,以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3-5秒。

4、置動(dòng)物于解剖臺(tái),用針頭固定四肢,持鑷撕開腹部皮膚,但勿傷及腹膜壁,把皮膚拉向上下兩側(cè),暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同時(shí)用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁,使液體在腹腔內(nèi)流動(dòng)。

6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè).使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。

7、小心拔出針頭,把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘后,去上清,加10ml Eagle培養(yǎng)基。

9、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細(xì)胞,其中90%為巨噬細(xì)胞。

10、以3×105個(gè)貼附細(xì)胞/平方厘米接種。

11、接種數(shù)小時(shí)后,除去培養(yǎng)液,可去除其它白細(xì)胞,純化培養(yǎng)細(xì)胞,用Eagle液沖洗1一2次,再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。 

第六節(jié) 腎小球分離、移植培養(yǎng)

SD大鼠頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡1~2分鐘,2次,置超凈臺(tái)內(nèi),打開腹腔取出腎臟剪碎,置含Hank's液的無菌培養(yǎng)皿洗滌,置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng),濾過組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng),濾過,去小組織塊,濾過物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng),輕輕濾過,Hank's液洗滌1次,收集網(wǎng)上腎小球,鏡下觀察為分離良好的腎小球。

腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶,37℃消化20分鐘,加血清終止胰酶反應(yīng),離心除去膠原酶。處理過的腎小球計(jì)數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶,使腎小球大于60個(gè)/cm2,加培養(yǎng)基5~10ml(培養(yǎng)基組成:F12—3T3上清1:1;5%馬血清;2.5%胎牛血清;胰島素5μg/ml;25ng/ml氫化可d松;5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲狀腺素0.02ng/ml;D-纈氨酸150ng/ml)腎小球培養(yǎng)8~10天,去除腎小球未生長(zhǎng)組分,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),形態(tài)學(xué)觀察:細(xì)胞生長(zhǎng)成單層多角型細(xì)胞,直徑約100μm。

第七節(jié) 裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng)

無菌條件下取出小鼠移植瘤組織,剪成1mm3小塊,用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時(shí),再加等體積0.2%胰酶消化5~8分鐘,在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置(分別作為加樣和收集器的兩個(gè)注射器中間加一小濾器連接而成,濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細(xì)胞)來回推動(dòng)注射器吹打組織以分離單細(xì)胞,終止酶消化方法同上。

常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細(xì)胞。

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