膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。由于它不存在內(nèi)源酶干擾及放射性同位素污染等問題，且利用不同顆粒大小的膠體金還可以作雙重甚至多重標(biāo)記，使定位更加。因此已成為繼熒光素、酶、同位素及乳膠標(biāo)記技術(shù)之后的一種新型標(biāo)記技術(shù)?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷試劑的制造等領(lǐng)域。

近年來，它更多的被應(yīng)用于免疫學(xué)和細(xì)胞學(xué)相關(guān)分子水平的檢測中。尤其隨著人們物質(zhì)生活的改善，有關(guān)人類健康的問題在現(xiàn)實(shí)生活中已顯得非常突出。

制備方法

在溶液中金顆粒呈圓形，邊緣平整，界線十分清楚。金顆粒表面帶有大量負(fù)電荷，由于靜電的排斥力，使其在水中保持穩(wěn)定狀態(tài)，形成穩(wěn)定的膠體，所以稱其為膠體金。膠體金的制作方法有白磷還原法，抗壞血酸還原法，檸檬酸三鈉還原法和鞣酸—檸檬酸三鈉還原法。通過改變反應(yīng)體系中氯金酸與還原劑的比例（即增加或減少還原劑的量）可得到所需不同直徑的金顆粒。

但前兩種方法制備得到的金顆粒直徑大小不均一，所以目前常用后兩種方法，以檸檬酸三鈉還原法為例，有兩種方法。

1、Frens標(biāo)準(zhǔn)方法：

（1）取0、01%HAuCl4溶液50mL,加熱煮沸，隨即快速加入1%檸檬酸三鈉溶液0.5mL.

（2）約過25s沸騰的溶液變?yōu)榈{(lán)色，大約再過70s，藍(lán)色突然轉(zhuǎn)變?yōu)榱良t色，

（3）繼續(xù)煮沸約5分鐘后結(jié)束反應(yīng)。

（4）冷卻后用0.1M K2CO3溶液調(diào)至所需PH值。

（5）此后再延長反應(yīng)時間或另加入額外的檸檬酸三鈉都不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

該法制備得到的金顆粒直徑約為41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金顆粒，該方法依然可行，*不同的是需要改變加入還原劑的量。另外，采用此標(biāo)準(zhǔn)方法所需反應(yīng)時間zui短。

2、Slot標(biāo)準(zhǔn)方法：

（1）取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，

（2）再加入2mL1%二水檸檬酸鈉溶液。

（3）將該混合溶液加熱煮沸約15~30min，直至溶液顏色變?yōu)榱良t色，

（4）冷卻后，用0.1M K2CO3溶液調(diào)整PH值，該法制備的金顆粒直徑約為15nm.

膠體金標(biāo)記蛋白的原理是：在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)所帶正電荷基團(tuán)之間產(chǎn)生靜電吸引而牢固結(jié)合，這種結(jié)合對所標(biāo)記蛋白的生物學(xué)活性無明顯影響。

膠體金免疫技術(shù)可大致分為液相膠體金標(biāo)記技術(shù)和固相膠體金標(biāo)記技術(shù)，其分類依據(jù)同酶免疫技術(shù)。

zui早的液相膠體金標(biāo)記技術(shù)叫免疫金染色法（IGS），它僅以膠體金作為標(biāo)記物和顯色劑。zui初的免疫金染色都采用單標(biāo)記。即采用大小均一的金顆粒進(jìn)行標(biāo)記。后來發(fā)展到可利用不同顆粒大小的膠體金作雙重標(biāo)記甚至多重標(biāo)記。但該方法均僅以膠體金顯色，需要較高濃度的標(biāo)記物，耗費(fèi)抗體或抗原的量較多，而且需要較大直徑的金顆粒（40-50nm），才能獲得較高的靈敏度，而且當(dāng)金顆粒過大時，標(biāo)記物不穩(wěn)定，長期貯存容易發(fā)生自動聚集。

為克服以上缺點(diǎn)，免疫金銀染色法（IGSS）應(yīng)運(yùn)而生。該方法的原理是，先用膠體金標(biāo)記物作免疫金染色，再加入含銀的物理顯影液，則銀離子靠電荷吸引，大量吸附于金顆粒周圍，使顯色結(jié)果呈現(xiàn)金屬銀的藍(lán)灰色，同時將顯色信號進(jìn)一步放大。應(yīng)用時，由于本法zui終顯色是靠金屬銀的吸附沉積，因此不需要高濃度的膠體金標(biāo)記物，將膠體金標(biāo)記物稀釋幾十倍，仍可獲得同免疫金染色一樣的*效果。這樣不僅可以節(jié)省大量的抗體或抗原標(biāo)記物，而且可以節(jié)省大量的膠體金。本方法靈敏度的關(guān)鍵在于膠體金吸附銀顆粒的數(shù)量。小直徑的膠體金比大顆粒膠體金能吸附更多的銀離子，而且小顆粒膠體金比大顆粒膠體金更為穩(wěn)定。所以，在同樣的能見度下，免疫金銀染色法所需的膠體金顆粒更為穩(wěn)定。所以在同樣的能見度下，免疫金銀染色法所需的膠體金顆粒也較小。據(jù)Holgate稱，免疫金銀染色法的靈敏度甚至比Sternberger的PAP法還要高出很多。該方法一度存在的主要問題在于背景染色過高，但1984年，Springgall等通過修改物理顯影操作程序，已基本解決這個問題。固相免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)出現(xiàn)較晚，其原理與液相標(biāo)記一樣。所不同的只是通過不同的方法zui終將膠體金標(biāo)記物吸附于固相支持物表面，近而進(jìn)行檢測。

常用的固相免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)有膠體金免疫層析法和膠體金免疫滲濾法。膠體金免疫層析法是根據(jù)層析原理，將膠體金標(biāo)記的抗原或抗體固定在層析用固相支持物上，通過層析作用，使抗原與抗體專一性結(jié)合。膠體金免疫滲濾法是讓抗原與膠體金標(biāo)記過的抗體分別濾過有一定孔徑的膜（常用NC膜），在此過程中抗原與抗體專一性結(jié)合，未專一性結(jié)合的抗體濾過膜。兩種方法都zui終通過膠體金聚集產(chǎn)生的顏色變化作為結(jié)果判斷的依據(jù)。為了減少膠體金用量，常常通過銀染加強(qiáng)顯色。

二、應(yīng)用

免疫膠體金技術(shù)可以快速，靈敏檢測特定蛋白，這種技術(shù)避免了復(fù)雜的操作，無需特殊檢測儀器，可以適應(yīng)多種檢測環(huán)境，以及多種檢測需要。并且，檢測結(jié)果可以長期保存，便于對照分析。使檢測更具有普遍性。 

免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)作為一種日臻完善的檢測技術(shù)，已被廣泛的應(yīng)用于眾多的科研領(lǐng)域中。本實(shí)驗(yàn)采用斑點(diǎn)免疫金—銀染色法（Dot-Immuno-Gold-Silver Straining Method，Dot-IGSS），利用NC膜可以與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)產(chǎn)生較強(qiáng)的疏水作用，從而使目標(biāo)蛋白與NC膜產(chǎn)生較強(qiáng)親和力的特性，以及NC膜易于被封閉的特點(diǎn)，使用NC膜作為固相載體。先使被FMDV免疫過的牛血清（含F(xiàn)MDV抗體蛋白）與NC膜結(jié)合，然后使用合適的封閉液將NC 膜未結(jié)合蛋白的位點(diǎn)封閉，再用膠體金標(biāo)記過的抗FMDV抗體蛋白的二抗與FMDV免疫過的牛血清作用（利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)），將未特異性結(jié)合的蛋白用PBN溶液和DDW洗脫。zui后，利用膠體金可以與銀離子產(chǎn)生電荷吸引，通過銀染加強(qiáng)顯色效果（膠體金本身呈淡紅色，銀染后呈藍(lán)黑色），使得可以通過肉眼直接觀察結(jié)果。本方法具有簡便快速，靈敏度高，可直接用肉眼判斷結(jié)果，無須特殊的設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)。