引言

細胞以何種方式對外部環(huán)境做出反應？就像人與人通過語言進行交流一樣，細胞也通過生理信號與其它細胞進行交流。在我們的體內(nèi)，與細胞間交流相關的生物促進劑誘發(fā)各種生理現(xiàn)象。貫穿細胞膜內(nèi)外的各種離子是主要的生物促進劑；其中，鈣離子是人體內(nèi)zui常見的信使。鈣離子在細胞的新陳代謝中起到zui重要的作用，從肌肉纖維收縮至激素分泌都離不開鈣離子。為獲得生理作用和生理信號信息，須觀察活細胞內(nèi)離子濃度的變化。目前，通常采用與離子結合時呈現(xiàn)熒光的 FURA-2 或 INDO-1 等螯合熒光探針（圖 1）觀察活細胞的離子濃度變化。上述熒光檢測方法的優(yōu)點在于不會破壞樣品，而且可實時檢測。

圖1. 鈣離子檢測的分子結構(FURA-2 (a)，INDO-1 (b))

根據(jù)離子濃度，熒光探針試劑的熒光光譜形態(tài)會發(fā)生變化。追蹤離子未結合光譜中zui大波長和離子結合光譜中zui大波長（FURA-2：340/380nm；INDO-1：405/480nm）下的熒光值，可計算濃度變化。不過，人體內(nèi)的鈣離子濃度變化以微秒為單位進行，而通用型熒光分光光度計以秒為單位通過光柵發(fā)生波長移動，因此利用現(xiàn)有的方法很難實現(xiàn)檢測。為此Thermo Fisher提供了檢測單位zui短可達 150微秒的快速濾波附件用于解決該問題（圖 2）?？焖贋V波附件可分別安裝4個激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片，可檢測瞬間發(fā)生的濃度變化。在本應用中，利用熒光粉分光光度計（Lumina）和快速濾波附件，觀察與熒光探針相結合的鈣離子的濃度變化趨勢。

圖 2. 快速濾波附件 (a) 和濾波片轉(zhuǎn)輪 (b)

試劑 

1.熒光分光計 (Lumina)

2.快速濾波配件（FURA-2 用帶通濾波片激發(fā)：340、380nm；發(fā)射：510nm

3.INDO-1 用帶通濾波片激發(fā)：355nm；發(fā)射：405、480nm）

4.100uM FURA-2（DMSO中）

5.100uM INDO-1（DMSO中）

6.1mM CaCl（DW中）

熒光比色皿

實驗步驟

1.為確認不同鈣離子濃度下的光譜變化，調(diào)制含量為0nM、100nM、200nM 的 FURA-2、INDO-1試劑。

2.利用波長掃描模塊，按濃度監(jiān)測 FURA-2 和 INDO-1 試劑的光譜。在此，FURA-2 需激發(fā)掃描，INDO-1 需發(fā)射掃描。

3.采用快速濾波模塊實時檢測不同鈣離子濃度下的熒光譜圖。

4.將填充熒光探針物質(zhì)的比色皿裝于快速濾波附件中。

5.根據(jù)檢測條件輸入設定值后，邊更改離子濃度邊檢測。以每 10 分鐘總濃度增加 100nM 的頻率，分 2 次注入鈣離子。

6.以每 10 分鐘總濃度增加 100nM 的頻率，分 2 次注入鈣離子。

儀器參數(shù)

圖 3. 波長掃描模式下的檢測條件 (FURA-2 (a)，INDO-1 (b))

圖 4. 快速濾波模式檢測條件

結果

圖 6(a)、(b)展示了波長掃描模式下檢測到的不同鈣離子濃度下FURA-2、INDO-1 光譜。根據(jù)檢測結果可確認，隨著濃度的改變，波長呈現(xiàn)漸進式變化。

總結

在本研究中，利用 Thermo Fisher 開發(fā)的熒光分光光度Lumina和快速濾波附件，確認了不同鈣離子濃度下離子熒光探針的熒光光譜變化。另外，通過鈣離子變化實驗，可確認兩個固有波長下的熒光強度發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，據(jù)此還可實時監(jiān)測離子濃度的變化。