所謂real-time Q-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。在 real-time 技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)在90年代早期，TaqSNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運用。

PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進入 平臺期。在傳統(tǒng)的PCR 中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的終擴增產(chǎn)物，因此用此中點法對PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)時間的進行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲 線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和終的平臺期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點 上來檢測PCR產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板初的含量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值，一般這個域值(threshold)是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號 ，熒光域值的缺省設(shè)置是3~15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義 樣本的域值循環(huán)數(shù)(Ct)。Ct值的含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的 對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣 品的起始拷貝數(shù)。