人尿激酶型纖溶酶原 (uPA)ELISA試劑盒

 (用于血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內(nèi))

一、原理：

  本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗人 uPA 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 uPA與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人uPA，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，uPA濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中uPA濃度。

二、試劑盒組成（2-8℃保存）

三、準(zhǔn)備試劑與收集血樣：

1. 10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
2. 收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時(shí)；更長時(shí)間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入0.8ml蒸餾水混勻，配成20ng/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，每管加入標(biāo)本稀釋液300ul。在管中加入20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液300ul混勻后用加樣器吸出300ul，移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出300ul棄去。第八管為空白對照。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

四、檢測程序：

1. 加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃40分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。
3. 每孔加入蒸餾水和抗體工作液各50ul(空白除外)。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃20分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃10分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。

五、結(jié)果計(jì)算與判斷：

1. 所有OD值建議減除空白值后再行計(jì)算。如空白OD低于0.1，也可以直接計(jì)算。
2. 以標(biāo)準(zhǔn)品10、5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.156、0 ng/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，使用軟件作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

   3.根據(jù)樣品OD值計(jì)算出相應(yīng)uPA含量。軟件可以向本公司郵件索取。

六、試劑盒性能：

    1.靈敏度：小的uPA 檢測濃度小于0.1npg/ml。

        2.特異性：可同時(shí)檢測重組或天然的人uPA。不與人其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。

    3.重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10％。

七、注意事項(xiàng)：

     1.以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

          2.洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。

         3.檢測時(shí)所有試劑都要恢復(fù)到室溫。板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

         4.試劑盒使用超敏TMB溶液，若顯色過深會出現(xiàn)絮狀物，屬正常現(xiàn)象，不影響結(jié)果判讀。

         5.說明書中試劑盒組成為96T的量，48T的量應(yīng)減半！

    6.本試劑盒宜置4^oC冰箱保存。僅用于科研，不能用于臨床診斷！