化繁為簡(jiǎn)！小翊帶你輕松搞定qPCR數(shù)據(jù)分析

熒光定量PCR（qPCR）是實(shí)驗(yàn)室常用的一種技術(shù)，該技術(shù)可以應(yīng)用于基因表達(dá)分析、基因分型、 病原體檢測(cè)、SNP分析等。 qPCR實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，原理易懂，但面對(duì)一堆凌亂的數(shù)據(jù)，如何進(jìn)行結(jié)果分析成了頭疼的問題，今天小翊將帶你學(xué)會(huì)如何化繁為簡(jiǎn)，輕松獲得可以發(fā)表SCI的數(shù)據(jù)！

qPCR常用的分析方法有相對(duì)定量和定量，需根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行選擇。本期我們關(guān)注的是qPCR常見的應(yīng)用—基因表達(dá)分析，一般選擇相對(duì)定量法。

1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

假設(shè)目前需要研究光誘導(dǎo)對(duì)擬南芥AtSUC2基因表達(dá)的影響，以未經(jīng)過任何處理的擬南芥植株作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為經(jīng)過一定光誘導(dǎo)處理過的植株，分別提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA為模板，選擇擬南芥GAPDH基因作為內(nèi)參，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

需要設(shè)置的qPCR孔如下：

1）NTC用來(lái)驗(yàn)證PCR體系中是否存在污染；

2）NRT是指用未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板，是對(duì)gDNA殘留的控制；

3）內(nèi)參基因用來(lái)校正因樣品初始濃度不同而造成的差異；

4）而對(duì)照樣品的選擇一般有以下幾種情況：

♦ 某處理方法對(duì)基因表達(dá)的影響，將未處理的樣本作為參照樣本；

♦ 檢測(cè)基因在不同時(shí)間的表達(dá)差異，將0時(shí)刻的樣本作為參照樣本；

♦ 比較基因在不同組織中的表達(dá)差異，人為選定一個(gè)組織作為參照樣本。

這里需要注意的一點(diǎn)是，上面每個(gè)材料都設(shè)置了3個(gè)PCR孔（1、2、3），這是PCR重復(fù)，即技術(shù)性重復(fù)，是為了消除操作誤差，正確評(píng)估擴(kuò)增效率。此外還需設(shè)置生物學(xué)重復(fù)，即不同的材料（時(shí)間、植株、批次、反應(yīng)板）做的同一實(shí)驗(yàn)，目的是校準(zhǔn)生物學(xué)誤差，分析處理是否具有統(tǒng)計(jì)意義。具體到本例中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都需要至少再處理兩組擬南芥樣本（A、B、C），分別提RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再做qPCR，統(tǒng)計(jì)時(shí)以三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值進(jìn)行分析。

2.結(jié)果分析——△△Ct法

△△Ct法的特點(diǎn)是只依靠Ct值來(lái)計(jì)算結(jié)果，但前提是目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率較為一致并且都在90-110%之間。具體的計(jì)算公式為：

△Ct= Ct（目的基因）- Ct（內(nèi)參基因）

△△ Ct= △Ct（實(shí)驗(yàn)組）- △Ct（對(duì)照組）

RQ=2^-△△Ct，RQ即為研究的目的基因在處理的樣本中相比對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。

假設(shè)上面研究光誘導(dǎo)對(duì)擬南芥AtSUC2基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)中，qPCR的結(jié)果如下：

計(jì)算時(shí)，首先我們把對(duì)照組的2^-△Ct數(shù)據(jù)求平均值（上圖中為0.00116），然后用2^-△Ct中的每一個(gè)數(shù)據(jù)除以這個(gè)平均值，即得到2^-△△Ct的值，后再整理得到平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，表明實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)量相比對(duì)照組提高了約9.73倍。結(jié)果用Graphpad軟件作圖如下：

利用軟件的t檢驗(yàn)計(jì)算出P value=0.0024<0.05，表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果可信。

3.結(jié)果分析——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

在實(shí)際應(yīng)用中，由于目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率常常是不同的，需要重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)條件使得擴(kuò)增效率相同，但其實(shí)我們還可以選擇更方便的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

這里我們先了解下定量的分析方法。具體的步驟是先通過PCR擴(kuò)增目的片段，然后將目的片段插入克隆載體中，提取重組質(zhì)粒，待測(cè)序正確后即可作為標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)粒DNA量可用Nanodrop等儀器測(cè)定，通過拷貝數(shù)換算公式轉(zhuǎn)換成具體的質(zhì)?？截悢?shù)，然后進(jìn)行倍比稀釋后擴(kuò)增。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品的Ct值就可以計(jì)算出其拷貝數(shù)。

拷貝數(shù)計(jì)算公式：拷貝數(shù)=（質(zhì)量÷相對(duì)分子質(zhì)量）×6.02×1023。

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法是通過分別構(gòu)建目的基因與內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行定量并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出未知樣品拷貝數(shù)之后再進(jìn)行比較，因此準(zhǔn)確性更高。

具體的計(jì)算公式為：

Q=目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)

RQ=Q實(shí)驗(yàn)/Q對(duì)照

假設(shè)上面研究光誘導(dǎo)對(duì)擬南芥AtSUC2基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)中，分別構(gòu)建AtSUC2與GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：

待測(cè)樣品目的基因和內(nèi)參基因的Ct值如下：

計(jì)算時(shí)，首先將目的基因與內(nèi)參基因的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系中，獲得目的基因與內(nèi)參基因分別在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的拷貝數(shù)，然后按公式Q=目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)，使得目的基因的表達(dá)量均一化。后按公式RQ=Q實(shí)驗(yàn)/Q對(duì)照，計(jì)算出RQ= 9.71，表示目的基因在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量比對(duì)照組上升9.71倍。

結(jié)果用Graphpad軟件作圖如下：

利用軟件的t檢驗(yàn)計(jì)算出P value=0.0008<0.05，表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果可信。

本期的qPCR數(shù)據(jù)分析就到這里結(jié)束了，下面小翊為你推薦一波產(chǎn)品，讓你的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確可靠，快來(lái)pick吧！