近期，我們介紹了 Leica SP8 FALCON 的一些應(yīng)用案例，它能實(shí)時(shí)測(cè)量分子間的相互作用 (FLIM-FRET)，實(shí)時(shí)測(cè)量鈣濃度變化，實(shí)時(shí)測(cè)量熒光分子的代謝 (如癌變引起的 NADH 的壽命變化) 或者所處微環(huán)境的變化 (如 pH)，能對(duì)光譜相近的不同染料或自發(fā)熒光和染料進(jìn)行拆分，還能與共聚焦的多種采圖模式 (如智能化大圖拼接、光譜掃描、時(shí)間序列、三維層切) 和技術(shù) (如 DIVE 多光子成像、STED 納米分辨率成像) 相結(jié)合?？傊?， FALCON 是熒光功能成像的極jia工具。

那么今天咱們就講講 FALCON 的使用技巧，幫助大家更好地理解這個(gè)新技術(shù)。

熒光壽命測(cè)量步驟

SP8 FALCON 的熒光壽命成像 (FLIM) 功能內(nèi)置在共聚焦操作軟件 LAS X 里，只需點(diǎn)擊 FLIM 即可激活 (見(jiàn)下圖)。

接下來(lái)，我們只需三步就可以完成熒光壽命測(cè)量。本文中所用樣品為雛菊 (Bellis Perennis) 花蕾。

1. 預(yù)覽及調(diào)節(jié)參數(shù)

點(diǎn)擊預(yù)覽，系統(tǒng)同時(shí)顯示熒光強(qiáng)度圖、平均熒光壽命圖和平均熒光壽命曲線，并以光子數(shù)直方圖中的紅線來(lái)提示光子數(shù)的理想上限 (見(jiàn)下圖)，便于我們調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度獲得理想的光子數(shù) (以接近但不超過(guò)紅線為宜)。

2. 設(shè)置條件并采圖

在采集時(shí)間、采集幀數(shù)及大光子數(shù)三者中選擇設(shè)置一項(xiàng)即可 (見(jiàn)下圖)，如果需要采集時(shí)間序列或者三維，按常規(guī)共聚焦采集模式設(shè)置總時(shí)長(zhǎng)或?qū)忧衅瘘c(diǎn)/終點(diǎn)即可。然后點(diǎn)擊 start 進(jìn)行采圖。

3. 數(shù)據(jù)分析

選擇壽命成分?jǐn)?shù)量 (見(jiàn)下圖一棕色箭頭)，點(diǎn)擊 Fit (圖一紅色箭頭)，系統(tǒng)即自動(dòng)進(jìn)行曲線擬合。壽命成分?jǐn)?shù)量可從 1 開(kāi)始，直至獲得滿意的擬合曲線 (見(jiàn)圖三)。同時(shí)，系統(tǒng)根據(jù)擬合結(jié)果顯示熒光壽命圖 （見(jiàn)圖二）。

到這里，圖像和數(shù)據(jù)的采集及分析就完成了，點(diǎn)擊保存圖像和結(jié)果即可。

一鍵采圖，一鍵擬合，so easy！

壽命成分拆分圖像

當(dāng)然，我們還可以根據(jù)擬合出的壽命成分對(duì)圖像進(jìn)行拆分，以上述分析結(jié)果為例，點(diǎn)擊 FLIM Image Fit，系統(tǒng)自動(dòng)按照擬合出的三種壽命進(jìn)行拆分，得到以下圖像。這特別適合于拆分光譜接近的不同染料或者染料和自發(fā)熒光。以后遇到多色熒光成像，再也不用擔(dān)心串色和分不開(kāi)了。

對(duì)厚樣品，F(xiàn)ALCON 還可以直接采集和顯示三維的熒光壽命圖像 (見(jiàn)下圖)，要做成視頻也*沒(méi)有問(wèn)題，用 LAS X 的 3D 重建模塊就可以。

SP8 FALCON 的功能還遠(yuǎn)不止于此，它還能進(jìn)行任意感興趣區(qū)域分析、FRET 分析、Pattern Match 分析，和 DIVE、STED 結(jié)合成像，以及近期剛剛增加的 Phasor 功能，為傳統(tǒng)的熒光成像增加維度、拓寬思路。有興趣的話，且聽(tīng)下回分解。