mNGS（二代測序）將顛覆我們在感染性疾病上的認知

肺泡灌洗和痰涂片、mNGS結(jié)果均為曲霉菌，痰和肺泡灌洗培養(yǎng)出來的卻是根霉菌，哪個環(huán)節(jié)出了問題？血mNGS結(jié)果為貓立克次體，序列總數(shù)53152條，而肺泡灌洗卻只有5條支原體？二代測序結(jié)果為陰道加德納菌，肺泡灌洗測出70多種細菌，是操作不當還是病人存在嚴重的衛(wèi)生問題？

以上實例都是臨床使用mNGS時出現(xiàn)的問題，浙大一院呼吸與危重癥醫(yī)學科的周華醫(yī)生在中青年呼吸學者論壇上進行了分享，那么，mNGS對病原學的診斷與傳統(tǒng)方法相比有什么優(yōu)勢？mNGS出現(xiàn)假陰性或假陽性時，我們該怎么辦？為何反復強調(diào)小心驗證的重要性？

感染性疾病診斷的核心難題是「病原診斷」

在開發(fā)出NGS技術(shù)之前，即使用遍所有的方法去診斷感染性疾病，還是會面臨很多困難，也就是說很多感染性疾病的病人無法及時精準診斷病原體，導致治療延誤或者治療不當，增加致死率，加重醫(yī)療花費。現(xiàn)在應用mNGS技術(shù)之后，很多病人還是無法明確病原體，因此我們需要探索新的方法。

目前病原微生物鑒定的檢測技術(shù)有哪些？

病原學檢測方法包括培養(yǎng)和非培養(yǎng)的方法。其中非培養(yǎng)方法包括直接涂片法，多用于細菌、真菌、 分枝桿菌檢測；還有抗原/抗體檢測，很早以前核酸檢測就應用于臨床，以前基于PCR技術(shù)或者多重PCR技術(shù)來做病原體檢測，隨著二代測序價格下降，二代測序就被用于臨床做感染病人的病原學診斷。

mNGS對病原學診斷與傳統(tǒng)方法相比，具有什么優(yōu)勢

mNGS指宏基因組二代測序（Metagenomic Next-generation Sequencing），臨床也稱之為二代測序、宏基因組測序、高通量測序。

宏基因組測序（Metagenomic Sequencing）對病原學診斷與常規(guī)的培養(yǎng)相比具有理論優(yōu)勢。

優(yōu)勢是沒有偏移性，比如一個標本中既有曲霉菌又有白色念珠菌，培養(yǎng)時，如果白色念珠菌生長較快，便會影響曲霉菌的生長，假如一口痰中既有白色念珠菌又有奴卡菌，白色念珠菌生長有優(yōu)勢可能影響了奴卡菌的陽性率。所以培養(yǎng)是有偏移性的，但理論上說，宏基因組測序?qū)Σ≡瓕W診斷沒有偏移性。

優(yōu)勢是廣覆蓋，對于常規(guī)的感染性疾病的診斷來說，我們根據(jù)臨床思維，判斷高危因素和病原體，選擇必要的檢測手段，如果評估不全面可能導致漏檢。理論上，宏基因組測序可以沒有偏移的把標本中所有病原體的核酸都檢測出來，所以覆蓋面更廣。

優(yōu)勢是高效率，可以同時檢測多種病原體。

 mNGS診斷方法的優(yōu)勢：「一網(wǎng)打盡」

類比一下，傳統(tǒng)的病原學檢測方法如同釣魚一樣，需要加上誘餌（引物或抗原抗體），一次只釣一種魚，或者使用多重PCR的方法，放幾個魚鉤一起釣，一次性釣幾種。而病原宏基因組學方法學就如同撒一張大網(wǎng)去全面覆蓋各種病原菌，將可能致病的病原菌一網(wǎng)打盡。

二代測序除了用于病原學診斷，還有哪些用途？

二代測序不僅可以用于病原學檢測，也可以在病原培養(yǎng)后做深度的二代測序，甚至全基因組分析。現(xiàn)在主要用于臨床的還是臨床標本病原學檢測，通過檢測可以知道標本中含有的病原體。如果測序量能夠進一步突破，它除了可以把標本中里所有微生物的核酸測出來外，也可以把人體表達的所有RNA測出來，幫助判斷定植或者感染。比如銅綠假單胞菌測出來后，人體有沒有針對它產(chǎn)生炎癥反應，還可以判斷是定植還是感染，但目前還在探索階段，尚常規(guī)未用于臨床。

 mNGS檢測有幾步？

目前對于二代測序來說，給它一個臨床標本，不經(jīng)過培養(yǎng)的話，還是只能用于病原學診斷。使用二代測序來做病原學診斷有六個基本步驟，一個是采集感染部位樣本，后一步是報告解讀，中間有四個步驟分別為提取核酸、高通量測序、生物信息分析、檢測結(jié)果報告，這四步都不由臨床醫(yī)生操作，由實驗室技術(shù)人員操作完成。其實我們臨床醫(yī)生要做好一步和后一步，也要了解中間的四步，在報告解讀的時候需要了解其中的技術(shù)問題，這樣才能讀懂報告。