市場上細胞計數(shù)儀琳瑯滿目，那么這些細胞計數(shù)儀的方法和原理主要是哪些呢？

 1.手工顯微鏡法

 又稱血球計數(shù)板法，是原始的細胞計數(shù)方法，顯微鏡下調整不同放大倍數(shù)的物鏡，通過染色的方法人工觀察細胞狀態(tài)判斷細胞死活，進行計數(shù)。通過檢測出一定體積的均勻細胞懸液中的細胞個數(shù)（對一定數(shù)量的小格或中格計數(shù)，根據(jù)相應的小/中格所占的體積，可以推算出單位體積的溶液中微生物細胞的密度或總數(shù)），換算出每毫升的細胞個數(shù)，從而得到細胞懸液的細胞濃度。實驗過程中采用五點取樣法，即一般隨計數(shù)室四角上的四個中方格以及正中間的一個中方格進行統(tǒng)計（對于壓線的，采取數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則）。這種方法數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，按照1個細胞計算。

圖1、血球計數(shù)板             

2.庫爾特原理

又稱電阻抗檢測原理。細胞是相對不良導體，當細胞懸浮電解質中，將小孔管插入細胞懸液，使其管內充滿稀釋液，位于小孔管兩側電極產生穩(wěn)定電流。當一個細胞通過小孔時，瞬間引起電壓變化出現(xiàn)一個脈沖信號，細胞體積越大，引起脈沖越大，產生脈沖振幅越高，脈沖信號由下列步驟完成：①放大；②閾值調節(jié)；③甄別；④計數(shù)。采用這種計數(shù)原理的儀器具有代表性的是CASY細胞計數(shù)儀，這種原理的儀器內置液路系統(tǒng)，需要定期清洗管路防止堵塞。

圖2、電阻抗法細胞計數(shù)原理

3.圖像法

通過高清攝像鏡頭獲取高清的樣品圖片，根據(jù)活死細胞的形態(tài)、顏色，軟件智能分析圖片的結果。目前市場上采用這種方法的儀器大致分為兩類，一類是明場細胞計數(shù)儀僅需簡單的臺盼藍染色，另一類是熒光場細胞計數(shù)儀，需要相應的熒光染料。

（1）經(jīng)典臺盼藍染色原理（明場細胞計數(shù)儀）：臺盼藍是細胞跨膜染料，活細胞膜結構完整，臺盼藍無法通過，細胞呈中心透亮具有明顯的輪廓。死細胞膜通透性改變，臺盼藍可跨過死細胞膜進入細胞內，使細胞顏色加深，呈現(xiàn)實心的圓點與活細胞中心透亮輪廓清晰有明顯的差異，根據(jù)這種形態(tài)的差異可以明顯區(qū)別活細胞和死細胞進行區(qū)別計數(shù)。市場上明場細胞計數(shù)儀均是采用這種臺盼藍原理進行活死細胞計數(shù)。我們Countstar明場細胞計數(shù)儀一代需要外接電腦的Biotech和二代一體機Altair就是采用臺盼藍染色原理進行細胞計數(shù)。

圖3、Countstar 明場細胞計數(shù)儀及檢測結果

我們的明場細胞計數(shù)儀，無論是Biotech還是Altair均選取3個視野進行統(tǒng)計分析，檢測視野的面積是血球計數(shù)板的6倍以上，這種高通量的樣本采樣量減少統(tǒng)計學誤差，使檢測結果更準確。另外，軟件部分采用智能分析方法，分別圈出活細胞、死細胞、成團細胞，成團細胞根據(jù)檢測的平均直徑智能分割，確保聚團細胞檢測的準確性。我們Counstar具有自主研發(fā)的“定焦”技術，無需手動調焦和自動定焦，保證樣品檢測結果的重復性和準確性。Tips：有部分使用者采用明場細胞計數(shù)儀時，直接用細胞原液上樣進行細胞計數(shù)，沒有使用臺盼藍染色，檢測結果僅供簡單的查看，沒有實際的參考意義。

圖4、Countstar明場細胞計數(shù)儀檢測結果分析

（2）AO/PI熒光染色原理（熒光場細胞計數(shù)儀）：AO/PI為細胞核染料，AO為吖啶橙是一種小分子染料，可以跨過所有細胞膜進入細胞內，使有核細胞標記上綠色熒光。PI是碘化丙啶一種大分子染料，只有細胞死亡膜通透性改變后才能跨膜進入細胞內，使死細胞的核標記上紅色熒光。AO/PI染細胞后，死細胞會同時染上AO和PI，AO的發(fā)射光波長532 nm左右，PI的激發(fā)光波長剛好與AO發(fā)射光波長相重，兩種染料同染上死細胞核時會發(fā)生熒光共振能量轉移（FRET），AO的發(fā)射光被PI吸收，所以死細胞只會顯示紅色熒光，而活細胞只有綠色熒光。因此，通過特異性染色的細胞上標記的紅色熒光和綠色熒光就可以快速辨別出死細胞和活細胞。目前市場上熒光場細胞計數(shù)儀基本采用這種計數(shù)原理，這種計數(shù)方法的特異性染色可以排除無核細胞、雜質、碎片等的干擾，主要用于原代細胞、培養(yǎng)時間長后期發(fā)酵細胞、PBMC細胞（排除紅細胞、血小板等無核細胞、雜質的干擾）等。下圖是我們Countstar Rigel（全自動熒光細胞計數(shù)儀）產品通過AO/PI進行PBMC細胞計數(shù)的結果圖。

圖5、Countstar熒光場細胞計數(shù)儀AO/PI計數(shù)

4.流式細胞術

利用流式細胞術使單個細胞隨著流體動力聚集的鞘流液在通過激光照射的檢測區(qū)時，使光束發(fā)生折射、衍射和散射，散射光檢測器接收后產生脈沖將光信號轉換為電信號，脈沖大小與被照細胞的大小成正比，脈沖的數(shù)量代表了被照細胞的數(shù)量。流式細胞術需要用到較為昂貴的特異性熒光試劑和相應的激發(fā)光、濾波片，使用成本較高，因此基本不采用流式細胞進行細胞計數(shù)，而是進行細胞群分析。

5.結語

細胞計數(shù)是細胞相關試劑（抗體、疫苗、細胞治療產品）的重要一環(huán)，檢測結果的準確度、重現(xiàn)性、便利性、成本等是使用者重要的參考指標。目前成像法原理的細胞計數(shù)儀因其可以直觀看到細胞形態(tài)以及軟件分析前后結果對比的優(yōu)勢在其他計數(shù)原理的產品中脫穎而出，深受廣大科研人員喜愛，下表是對上述原理分析的統(tǒng)計。