盤一盤柱層析在工藝放大的注意事項

工藝成功放大且穩(wěn)定一直是工藝工程師們致力的方向。要學會擺脫實驗室的思維定勢，根據(jù)車間實際情況、實際設備、實際工藝，從宏觀控制出發(fā)，多多注意細節(jié)，多多完善工藝。

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柱層析分離技術，在小分子藥物的實驗室研發(fā)和大規(guī)模生產中被廣泛應用。對于工藝開發(fā)人員來說，如何在放大中精確還原研發(fā)里的工藝，是一門精密的科學，也是一項具有挑戰(zhàn)的藝術。下面我們以硅膠填裝柱為例，詳細梳理柱層析在工藝放大中的注意要點。

1.  工藝放大參數(shù)選擇

柱層析的研發(fā)數(shù)據(jù)通常包括：樣品量、硅膠型號以及量、柱子高度、流動相成分和比例、流速以及產品分離時段。

我們先用色譜分離基本方程來還原研發(fā)工藝

這個公式說明分辨率與塔板數(shù)、選擇性、滯留因子之間的關系。

在放大的過程中，由于研發(fā)工藝已經確定，硅膠型號、流動相成分和比例這幾個關鍵因素都是已知，所以分離的選擇性和滯留因子也是確定的。但在車間生產的時候，還需要保證硅膠的壓實程度，要根據(jù)實驗室裝填硅膠柱的密度等同放大，還要保證填裝硅膠的浸潤程度，通過流動性出口氣泡情況或者通過反向填料確認一致性。換言之，工程師更加注重模擬實驗室填裝柱的理論塔板數(shù)。

一般情況下，工程師會盡量保證柱子高度一致，通過擴大柱子的直徑來滿足放大的要求，也就是等板高度?？墒乔闆r往往不會和想象一致，實際上，車間的柱子的直徑經常無法滿足放大的系數(shù)。這時候，單純地增加或者減少硅膠的量，以期滿足高度的要求，則會在實際生產過程中對于柱層析線速度參數(shù)的選擇上出現(xiàn)偏差，或者與實驗室的情況不一致。

對此，老工程師的經驗是時間。由于硅膠，產品以及流動相（洗脫劑）均已經確定，所以影響實驗室和車間柱層析放大過程中的質傳的關鍵點就在于時間。因此，可以引入一個接觸時間的概念：即在車間放大的柱層析，流動相和吸附在硅膠上的產品之間的接觸時間需要和實驗室中的保持一致。我們可以通過一個簡單的公式計算：




通過公式，我們得到了車間柱層析中的流動相的流量流速，等于說線速度也確定了。根據(jù)線速度再設計的柱子的參數(shù)。

1.  吸附的熱效應

網(wǎng)絡上能找到很多關于柱層析的注意事項，但是基本都是關于實驗室的操作。在車間生產時會遇到一些不一樣的問題，有的還很嚴重問題，甚至實驗大牛都可能忽略，例如吸附的熱效應。

從柱層析的原理來說，不管運用的是溶解度差異，還是分子間作用力，基本都是吸附-解吸附的過程。所以，這里先重點說說硅膠柱層析分離工藝。

用于填裝柱子并分離有機物（非氣體）的硅膠，主要利用硅膠的羥基，用硅醇基團作為吸附中心，利用氫鍵或者分子間誘導力進行吸附，然后在洗脫劑的作用下進行解吸附。不同物質吸附和解吸附的快慢不一樣，分離的目的也就達到了。

但是在吸附的過程中，樣品跟硅膠的羥基在結合時會放熱，尤其是濕法上樣階段，大量樣品短時間內吸附，放熱量很大。如果用低沸點的洗脫劑，比如二氯甲烷，熱效應會很明顯。氣化的二氯甲烷會造成硅膠柱的壓力變化，造成明顯的空洞或者斷層，大大影響分離。實驗室里是這樣，在車間放大生產時，熱效應加劇，可能直接造成分離失敗。所以，在放大生產中要想辦法避免或緩解放熱帶來的影響。

對策如下：

第一、降低洗脫液的溫度

一般車間會使用反應釜或者移動罐進行洗脫液的配制，在這種情況下，可以通過夾套控溫，將洗脫液的溫度控制在一個較低的合理范圍。

第二、避免壓力的變化

熱效應導致的壓力變化可能引起硅膠柱的空洞或者斷層，但這種損害有時并不是那么明顯。所以在確定壓力和線速度的前提下，應該避免過多的操作柱子，也不要頻繁改變洗脫液的壓力，防止影響柱子本身的壓力。需要注意的是，停柱子的時候——例如配制柱子完成時，停止收樣時或者配制洗脫液時——柱子壓力往往會出現(xiàn)很大的波動，這時要按照緩沖壓力的順序來操作設備。車間柱層析的常見設備如下圖，在圖上標注了相應區(qū)域的閥門(A、B和C)。

停止柱層析時應該：

1．先關閉A區(qū)域的閥門，這樣層析柱下層空間的壓力會上升，最終流速歸零的時候，則層析柱上下方會保持恒定一致的壓力；

2、 然后在關閉閥門B以及C, 這樣層析柱就處于一個密封狀態(tài)。

3、 接下去就是重點了：重新開啟柱層析。

所以，常規(guī)操作順序是：打開C和B，然后再打開A。

這種方式在實驗室肯定沒問題，因為實驗室操作相對較快，幾乎可以同時在B處加壓且打開A處的閥門。車間可能操作相對具有延后性，且此時需要提醒的是，B區(qū)域相對于A區(qū)域來說，密封性會更差（具有壓力表，排空閥之類的多處接口），且洗脫劑從C到B是需要一定的時間，而先打開B處的閥門，有可能會導致B處的壓力驟降進而A處的壓力或者層析柱內部的壓力會反向沖擊B處，而導致內部形成斷層以及空洞。所以，在車間內重新啟動層析柱時需要另外的流程：

1、 先打開C處閥門，然后打開A處閥門，此時A處以及層析柱內部的壓力會從下而上逐步降低，形成洗脫劑的流速。

2、 等待B處壓力表逐漸衰減成常壓后，打開B處排氣閥門；

3、 打開B處閥門進入洗脫劑的補充；

4、 關閉B處排氣閥門進行壓力的補充并通過控制A閥門控制到合理的流速。

當然上述的流程也可以在停柱子前完成，主要目的還是使壓力緩慢從出口泄出，避免從B段進行壓力的驟然衰減。

第三、控制洗脫劑的水含量

還記得硅膠的吸附原理么？其實就是利用氫鍵或者分子間誘導力進行吸附，并在洗脫劑的作用下進行解吸附。如果洗脫劑中有水分的存在，就會破壞氫鍵作用。所以，在放大過程中，我們一般會選擇和實驗室相同品質的洗脫劑，這樣能對洗脫劑含水量有一定控制，以免對分離產生影響。但由于生產中，成本是重要的考量標準，所以車間使用柱層析進行放大時，在一定程度上會使用洗脫劑的回收工藝。

很多人常常只關注組成和比例，忽視其中的水分。這里需要提醒大家，硅膠是具有一定水分的，隨著洗脫劑的回收，其中的水分會不斷增加，尤其是多次回收后。因此，工程師在考慮洗脫劑回收的時候需要把水分的因素考慮其中，確保工藝的穩(wěn)定，避免出現(xiàn)柱層析的異常。

第四、防止非預制色譜柱的空洞或塌陷

這個問題，一直是工藝工程師們想努力克服的重點。其實不管使用干法還是濕法填柱，色譜柱均有一定概率出現(xiàn)空洞或塌陷，比如硅膠的性狀，柱子內部的光滑程度，平整度和壓力等等因素，都會影響色譜柱。

總結

工藝成功放大且穩(wěn)定一直是工藝工程師們致力的方向。要學會擺脫實驗室的思維定勢，根據(jù)車間實際情況、實際設備、實際工藝，從宏觀控制出發(fā)，多多注意細節(jié)，多多完善工藝。

—— 工藝研究員 高鈺，沈曄晨