熒光顯微鏡原理

北京北方安道科技——顯微鏡專業(yè)供應(yīng)商
   王瓊
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        熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像

（一）光源
　　現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀*蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過(guò)程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類(lèi)熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。
　　超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。
　　新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時(shí)間后，則需要高壓?jiǎn)?dòng)（約為15000V），啟動(dòng)后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開(kāi)動(dòng)一次工作時(shí)間愈短，則壽命愈短，如開(kāi)一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)。燈泡在使用過(guò)程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強(qiáng)烈，因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作。
　　超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。在燈室上有調(diào)節(jié)　燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。
　　國(guó)產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡，平均壽命在200h以上，價(jià)格也比較低。
　　我國(guó)研制的一種簡(jiǎn)易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶直流電源），易于攜帶，使用方便，已推廣應(yīng)用。

（二）濾色系統(tǒng)
　　濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號(hào)，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn)。如德國(guó)產(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的*個(gè)字母，G是玻璃的*個(gè)字母；我國(guó)產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾板名為QB24，Q是青色（藍(lán)色）拼音的*個(gè)字母，B是玻璃拼音的*個(gè)字母。不過(guò)有的濾板也可以透光分界濾長(zhǎng)命名，如K530，就是表示壓制濾長(zhǎng)530nm以下的光而透過(guò)530nm以上的光。還有的廠家的濾板*以數(shù)字命名，如美國(guó)Corning廠的NO：5-58，即相當(dāng)于BG12。

1．激發(fā)濾板　 根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類(lèi)激發(fā)濾板，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。
　　紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過(guò)，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。常用型號(hào)為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
　　紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過(guò)。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
　　紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過(guò)。常用型號(hào)為QB24（BG12）。
　　zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達(dá)明色素）可用藍(lán)綠濾板（如B-7）激發(fā)。
　　近年開(kāi)始采用金屬膜干涉濾板，由于針對(duì)性強(qiáng)，波長(zhǎng)適當(dāng)，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITCKP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板，均遠(yuǎn)比玻璃濾板效果好。
　　激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些?；疽笫且垣@得zui明亮的熒光和的背景為準(zhǔn)。
　　2．壓制濾板 壓制濾板的作用是*阻擋激發(fā)光通過(guò)，提供相應(yīng)濾長(zhǎng)范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對(duì)應(yīng)，常用以下3種壓制濾板：
　　紫外光壓制濾板：可通過(guò)可見(jiàn)光、阻擋紫外光通過(guò)。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。
　　紫藍(lán)光壓制濾板：能通過(guò)510nm以上濾長(zhǎng)的熒光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
　　紫外紫光壓制濾板：能通過(guò)460nm以上波長(zhǎng)的熒光（藍(lán)到紅），可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490，K510。

　　（三）反光鏡
　　反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因?yàn)殇X對(duì)紫外光和可見(jiàn)光的藍(lán)紫區(qū)吸收少，反射達(dá)90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。

　　（四）聚光鏡
　　專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。

　　1．明視野聚光器　 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強(qiáng)，使用方便，特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。

　　2．暗視野聚光器 　暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無(wú)色濾板（不透過(guò)紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。

　　3．相差熒光聚光器　 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。

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　　各種物鏡均可應(yīng)用，但用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長(zhǎng)范圍）適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時(shí)其影響非常明顯。因此對(duì)熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。

　　（六）目鏡
　　在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過(guò)去多用單筒目鏡，因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。

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　　新型的落射光裝置是從光源來(lái)的光射到干涉分光濾鏡后，波長(zhǎng)短的部分（紫外和紫藍(lán)）由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當(dāng)濾鏡對(duì)向光源呈45。傾斜時(shí)，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標(biāo)本，使標(biāo)本受到激發(fā)，這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí)，濾長(zhǎng)長(zhǎng)的部分（綠、黃、紅等），對(duì)濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標(biāo)本的熒光處在可見(jiàn)光長(zhǎng)波區(qū)，可透過(guò)濾鏡而到達(dá)目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高，在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標(biāo)本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。

　　　　二、使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)
　　（1）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。
　?。?）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛*適應(yīng)暗室，再開(kāi)始觀察標(biāo)本。
　?。?）防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。
　　（4）檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，zui多不得超過(guò)2～3h。
　?。?）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)　省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。
　?。?）標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。
　?。?）熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“一”—無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光。“+”—僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光。“++”—可見(jiàn)有明亮的熒光。“+++”—可見(jiàn)耀眼的熒光。

　　三、熒光圖像的記錄方法
　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來(lái)綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果，如用細(xì)胞分光光度計(jì)，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。

　　熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來(lái)。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。

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