內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基的背景與應(yīng)用！

一、背景

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基是專門為正常人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)設(shè)計的其生長的*培養(yǎng)基。是經(jīng)滅菌的液體培養(yǎng)基，包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質(zhì)和低濃度胎牛血清(5%)。該培養(yǎng)基緩沖體系為重碳酸鹽，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡后pH值為7.4。該培養(yǎng)基的配方能夠選擇性的促進(jìn)正常人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長，并為其達(dá)到營養(yǎng)平衡狀態(tài)。

內(nèi)皮細(xì)胞是一薄層的上皮細(xì)胞，由一層扁平細(xì)胞所組成，呈多邊形，細(xì)胞的邊緣呈鋸齒狀，相互嵌合。內(nèi)皮細(xì)胞也稱血管內(nèi)皮細(xì)胞，通常指襯于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平上皮，它形成血管的內(nèi)壁。它們具有吞噬異物、細(xì)菌、壞死和衰老的組織，還參與機體免疫活動功能。

血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）位于血漿與血管組織之間，它不僅能完成血漿和組織液的代謝交換，并且能合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，以保證血管正常的收縮和舒張，起到維持血管張力，調(diào)節(jié)血壓以及凝血與抗凝平衡等特殊功能，進(jìn)而保持血液的正常流動和血管的長期通暢?？鼓牧媳砻鎯?nèi)皮細(xì)胞化，可以減少血栓的形成和血小板激活。

完整內(nèi)皮細(xì)胞化是抗凝血，表面血管內(nèi)皮組織是天然的抗凝血組織。內(nèi)皮細(xì)胞膜上有天然的抗凝血成分，比如肝素，前列腺素（PGI），一氧化氮等，內(nèi)皮細(xì)胞能夠合成和分泌多種內(nèi)皮衍生舒張因子。

二、應(yīng)用

用于角膜內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立：

通過對四個部分結(jié)果的綜合分析得出角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型。

1、剝離帶后彈力層的兔角膜內(nèi)皮片，用雙酶消化法（胰蛋白酶和膠原酶）及組織片法對角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長情況，經(jīng)觀察分析得出的細(xì)胞數(shù)量多、污染少的較好分離方法，為后續(xù)階段采用。

2、選取F99培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、KSFM培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基分別對兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長情況。經(jīng)分析討論得出細(xì)胞增殖快、細(xì)胞形態(tài)好的培養(yǎng)基，后續(xù)階段沿用。

3、采用消化法、與3T3細(xì)胞共培養(yǎng)法、細(xì)胞克隆培養(yǎng)法對兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長情況，得出細(xì)胞傳代快、傳代較久的培養(yǎng)方法。

4、對人、豬、小鼠、兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光鑒定，選出細(xì)胞形態(tài)維持好、傳代時間長的一種角膜內(nèi)皮細(xì)胞。

三、結(jié)果

1、經(jīng)雙酶消化法培養(yǎng)20天后，兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞呈多邊形或多角星形，細(xì)胞形成單層，未見長梭形的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞。組織片法培養(yǎng)2周后可見及部分呈長梭型放射狀生長的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞生長其中。

2、F99培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原代兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞在第25天融合成單層，細(xì)胞呈多角形、細(xì)胞數(shù)量多，在三種培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)最規(guī)則，細(xì)胞數(shù)目最多，融合時間。第2次傳代的第4天，F(xiàn)99培養(yǎng)基培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)最多，且形態(tài)規(guī)則。

3、消化法中經(jīng)消化后細(xì)胞貼附快，細(xì)胞形態(tài)好，消化傳代后，細(xì)胞培養(yǎng)4-5天即形成新的單層細(xì)胞，在傳至第10代后仍維持較好的生長態(tài)勢。而兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞與3T3細(xì)胞共培養(yǎng)后，第5天可見明顯的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞呈密集的“鵝卵石”樣形態(tài)。培養(yǎng)至第14天細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯減少，剩余的細(xì)胞呈細(xì)胞核體積增大、顏色加深的衰老跡象?？寺∨囵B(yǎng)法中角膜內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)7天后形成克隆球，擴(kuò)大培養(yǎng)2代后細(xì)胞體積變大，增殖緩慢。

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