前言：由于母嬰飲食中硒的缺乏，導(dǎo)致一些新生兒血清樣品中的硒含量?jī)H處 于 20 µg/L 的痕量水平 [9]。 此前業(yè)內(nèi)已發(fā)表了大量有關(guān)通過(guò) GFAAS 測(cè)定血液和血清中的硒的分 析方法 [1,5,6,7,9]。本研究介紹了新儀器和程序的應(yīng)用，這對(duì)于獲得最 高準(zhǔn)確度和精密度非常重要。

硒的測(cè)定面臨著諸多困難：

• 196.0 nm 的共振波長(zhǎng)處于遠(yuǎn) UV 區(qū)，樣品中可能存在的有機(jī)化合物 和無(wú)機(jī)化合物在該波長(zhǎng)下均會(huì)產(chǎn)生分子吸收。這一問(wèn)題可通過(guò)塞 曼背景校正加以解決 利用塞曼石墨爐原子吸收光譜測(cè)量血 清中的硒 應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào) 作者 John Sanders 安捷倫科技公司 澳大利亞墨爾本 臨床研究 2

• 傳統(tǒng)空心陰極燈在該波長(zhǎng)下的強(qiáng)度導(dǎo)致精密度 有限 [6]。而增強(qiáng)放電空心陰極燈可提高光源的 強(qiáng)度，從而降低噪音水平。此外，選擇特殊的 光電倍增管有助于在該光譜區(qū)提供優(yōu)異的響應(yīng)

• 在血清這種復(fù)雜的樣品基質(zhì)中，硒可能存在于 各種化學(xué)物質(zhì)中的任何一種中，這會(huì)導(dǎo)致石墨 爐的原子化器產(chǎn)生原子化問(wèn)題。采用化學(xué)改性 劑能夠解決這一問(wèn)題

• 硒的揮發(fā)性非常強(qiáng)，可能在灰化階段產(chǎn)生損 失。必須使用合適的改性劑與硒形成化合物， 以使分析物在原子化之前能夠在較高的灰化溫 度下盡可能多地除去基質(zhì)

實(shí)驗(yàn)部分 儀器 本研究使用 Agilent SpectrAA-880 塞曼石墨爐原子吸收光譜儀和可編程進(jìn)樣器。 該儀器配備了 R166UH 光電倍增管，并在 15 mA 陰 極電流和 20 mA 增強(qiáng)電流下操作 Se 增強(qiáng)放電空心 陰極燈。 所需試劑 10% 的消泡劑 B 乳濁液 (Sigma Chemical)。重要的 是，消泡劑應(yīng)為具有純白色乳狀外觀的穩(wěn)定的不分 散乳液。而來(lái)自其他供應(yīng)商的消泡劑產(chǎn)品批次出現(xiàn) 了分離現(xiàn)象；這種分離的材料不能滿足要求。 Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚 (BDH) 硒標(biāo)準(zhǔn)品 1000 mg/L Mallinckrodt AA 標(biāo)準(zhǔn)品 Seronorm 標(biāo)準(zhǔn)品 Nycomed Pharma AS Norway 批次號(hào) 010017血清對(duì)照樣品 UTAK 痕量元素對(duì)照樣品，正常 濃度，批號(hào) 7772 L-抗壞血酸 BDH AnalaR 級(jí) 氯化鈀 1000 mg/L Mallinckrodt AA 標(biāo)準(zhǔn) 品，PdCl2

試劑制備：樣品稀釋劑 0.056% wt/vol 抗壞血酸 0.088% vol/vol Triton X-100 0.1% vol/vol 消泡劑“B” 配制樣品稀釋劑：將 0.56 g 抗壞血酸、0.88 mL Triton X-100 和 1 mL 消泡劑 B 溶于少量去離子水中，加入 0.1 mL 鹽酸并將溶液稀釋至 1.0 L。 加入鹽酸以降低溶液的 pH，并確保在稀釋劑與血 清樣品混合時(shí)獲得澄清溶液。盡管該溶液可保持 穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá) 2 天時(shí)間，還是建議使用當(dāng)天配制的新鮮 溶液。 自動(dòng)進(jìn)樣器清洗 0.05% Triton X-100，0.1% 消泡劑 B 移取 0.5 mL Triton X-100 和 1.0 mL 消泡劑 B 至 1 L 標(biāo) 準(zhǔn)燒瓶中，用去離子水稀釋至 1.0 L。 改性劑 500 mg/L 鈀，0.05% Triton X-100，0.1% 消泡劑 B： 移取 10 mL 1000 mg/L 的鈀標(biāo)準(zhǔn)品和 2 mL 濃鹽酸至 20 mL 標(biāo)準(zhǔn)燒瓶中。加入 100 µL Triton X-100 和 20 µL 消泡劑 B，并用去離子水稀釋至 20 mL。 標(biāo)樣 標(biāo)樣原液 1.00 mg/L 3 通過(guò)使用蒸餾-去離子水將 10.00 mL 的 1000 mg/L 標(biāo) 準(zhǔn)品稀釋至 1 L 來(lái)配制 10 mg/L 的標(biāo)樣，然后通過(guò) 使用樣品稀釋劑將 10.00 mL 10 mg/L 的標(biāo)樣稀釋至 100 mL 來(lái)配制 1.00 mg/L 標(biāo)樣。

工作標(biāo)樣 依據(jù)表 1 所列的比例，分別將不同量的由樣品稀釋 劑配制而成的標(biāo)樣添加至每份 Seronorm 標(biāo)準(zhǔn)品中 配制工作標(biāo)樣。 所有溶液均在標(biāo)準(zhǔn)燒瓶中稀釋至最終體積為 10 mL。 在配制溶液過(guò)程中，將 Seronorm 標(biāo)準(zhǔn)品添加至 10 mL 干燥的燒瓶中，然后加入 1 mg/L 的標(biāo)樣。靜置約 一小時(shí)，然后用樣品稀釋劑稀釋至最終體積。

自動(dòng)進(jìn)樣器準(zhǔn)備 將自動(dòng)進(jìn)樣器清洗瓶注滿 Triton X-100/消泡劑 B 清洗 液，按照操作手冊(cè)中推薦的方法對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行吹掃。 樣品毛細(xì)管的必須保持嚴(yán)格清潔，并且應(yīng)在每 次自動(dòng)運(yùn)行開(kāi)始時(shí)用王水進(jìn)行清洗。該清洗過(guò)程最 好通過(guò)以下方式進(jìn)行：將酸注滿樣品瓶并手動(dòng)將自動(dòng)進(jìn)樣器探頭的浸至酸 中。然后使用進(jìn)樣注射器將酸吸入毛細(xì)管中，確保 所有殘留物和污染物均被移除。采用注射器將酸推入并吸出毛細(xì)管，使酸與毛細(xì)管 接觸 2–3 min。 最后使用 Rinse（清洗）命令除去酸并清洗毛細(xì)管 兩到三次。

樣品前處理 注意：所有樣品都應(yīng)視為潛在的生物危害物，在樣 品處理中必須遵守當(dāng)?shù)匦l(wèi)生管理局所要求的全部安 全預(yù)防措施。 用樣品稀釋劑按 1:10 的比例稀釋樣品（在樣品體 積有限的情況下，可在微量水平進(jìn)行）：用 90.0 µL 樣品稀釋劑稀釋 10.0 µL 樣品，并將其直接放入樣 品杯中。 為保持樣品與標(biāo)樣添加組中的改性劑濃度與添加劑 相同，不得用蒸餾水稀釋樣品。 分析 采用 SpectrAA-800 標(biāo)簽文件創(chuàng)建樣品列表以進(jìn)行樣 品識(shí)別。該列表可直接從其他數(shù)據(jù)文件（如逗號(hào)分 隔的文件）中導(dǎo)入。所示的方法采用添加預(yù)混合標(biāo) 樣的方式，目的是獲得準(zhǔn)確一致的報(bào)告結(jié)果。由于 樣品的復(fù)雜性，需要使用預(yù)混合的標(biāo)樣。 設(shè)置表 2 中所列出的操作條件并啟動(dòng)序列操作。 利用 SpectrAA-800 軟件中所包含的 QC 方案，該系 統(tǒng)可通過(guò)自動(dòng)重新校準(zhǔn)或發(fā)出可疑結(jié)果警告來(lái)監(jiān)視 對(duì)照樣品的性能和儀器性能。

校準(zhǔn)曲線在吸光度 0.3 以上基本呈線性，如圖 1 所 示。校準(zhǔn)曲線的回歸方程為： ABS = 0.00082786*Conc + 0.00000003*Conc [2]。 這說(shuō)明能夠放心地在更廣泛的分析范圍內(nèi)采用標(biāo)樣 添加技術(shù)及其應(yīng)用。

對(duì)石墨管進(jìn)行老化處理十分必要，需要使用樣品或 空白對(duì)石墨管進(jìn)行 6 至 9 次空燒，從而在管內(nèi)形成 涂層。一旦形成，則不得破壞該涂層。避免使用管 線清洗功能去除殘留物。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該方法能夠 分析 40–80 個(gè)樣品且不受血清灰分殘留的干擾。使 用管線清洗功能將導(dǎo)致石墨管的壽命大大縮短且精 密度下降。

使用鈀作為改性劑十分方便和有效 [4,5,8]。盡管在 Se 測(cè)定中也推薦使用其他改性劑，例如鎳，但是 使用鎳會(huì)導(dǎo)致石墨爐中的鎳殘留量較高。如果用戶 隨后希望分析痕量的鎳，這將會(huì)帶來(lái)麻煩。 儀器基線噪音水平會(huì)限制分析的精密度。研究發(fā) 現(xiàn)，有兩種可用途徑能夠減小該噪音源。 首先，使用增強(qiáng)放大空心陰極燈提高燈的光輸出。 其次，利用特殊的 UV 敏感型光電倍增管（如 Hamamatsu R166UH）也可獲得更高的增益，相比 于普通 R446，該光電倍增管在低 UV 區(qū)的輻照靈敏 度提高了將近六倍。R166UH 光電倍增管的另一項(xiàng) 優(yōu)勢(shì)在于其在可見(jiàn)光區(qū)具有極小的響應(yīng)，因此在 使用 2500 °C 以上的原子化溫度時(shí)，不易受到散射 石墨爐輻射所形成的噪音的影響。圖 3 和 4 對(duì)使 用不同光源和檢測(cè)器獲得的信號(hào)進(jìn)行了比較。使 用 R166UH 和增強(qiáng)放電空心陰極燈獲得的改善非常 明顯，并體現(xiàn)在分析的精密度中。此外，使用增強(qiáng) 放電空心陰極燈和 R166UH 光電倍增管還可降低檢 測(cè)限。

將增強(qiáng)放電空心陰極燈用于硒的測(cè)定的另一項(xiàng)優(yōu)勢(shì) 在于靈敏度提高，這是由于同傳統(tǒng)的空心陰極燈相 比，其在 196.0 nm 共振譜線處的信噪比得以提高。 硒的形態(tài)分析是石墨爐原子化的一個(gè)已知問(wèn)題，如 Jacobson 和 Lockitch [9] 以及 Johannessen 等人 [4] 所述。這使對(duì)于通過(guò)各種技術(shù)獲得的結(jié)果的總體有 效性產(chǎn)生了一些擔(dān)憂。在此背景下，本分析采用峰面積而非峰高可能更為有利。SpectrAA-800 特別適 用于本項(xiàng)工作，在分析低吸光度水平的樣品時(shí)，可 獲得足夠高的數(shù)值分辨率，例如小數(shù)點(diǎn)后四位數(shù)， 并且能夠同時(shí)記錄峰高和峰面積結(jié)果。此外，還能 夠查看每次空燒的曲線，從而在確定最終結(jié)果時(shí)可 以將那些表現(xiàn)出假峰或異常峰形的譜峰排除。表 3 數(shù)據(jù)在不同日期內(nèi)獲得，表明對(duì)于 UTAK 對(duì)照樣品 （批號(hào) 7772），通過(guò)峰面積和峰高均獲得了出色的 分析結(jié)果。

利用石墨爐 PROMT 測(cè)量模式還可以提高分析速 度。在該模式下，用戶可定義所需的精密度和最多 重復(fù)測(cè)定次數(shù)。一旦獲得期望的精密度，系統(tǒng)將自 動(dòng)轉(zhuǎn)到下一個(gè)樣品。與此同時(shí)，自動(dòng)進(jìn)樣器在當(dāng) 前樣品原子化的過(guò)程中準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣的溶液。 相比于傳統(tǒng)儀器，每個(gè)溶液的分析速度可節(jié)省約 30 秒，獲得具有已知精密度的結(jié)果，能夠節(jié)省大 量時(shí)間。 血清的復(fù)雜性導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂肪物質(zhì)積累在樣品 探頭中和樣品探頭周圍。采用包含乳化硅油的消泡 劑 B 可以在探頭的潤(rùn)濕表面上形成一層薄的硅油涂 層，使其具有疏水性并確保表面清潔。這樣可避免 交叉污染并提高重現(xiàn)性。 消泡劑 B 還使改性劑和樣品均勻分散于石墨管中， 可在關(guān)鍵的干燥和灰化階段中減少起泡。

結(jié)論 本文所述的程序?yàn)榉治鲅逯械奈峁┝艘环N 可靠的分析方法，濃度 100 µg/L 下的變異系數(shù)優(yōu) 于 5%。