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不同蛋白濃度測(cè)定方法優(yōu)缺點(diǎn)

來源:北京和一生物科技有限公司   2022年03月07日 17:10  

1.    BCA法測(cè)定試劑盒

堿性條件下,蛋白將Cu2+還原為Cu+, Cu+BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物,測(cè)定其在562nm處的吸收值,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比,即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。不方便的是這種方法需要提前制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。BCA蛋白質(zhì)測(cè)定方法靈敏度高,操作簡(jiǎn)單,試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳。BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質(zhì)濃度檢測(cè),可兼容高達(dá)5%SDS,TritonX-100Tween等。然而,由于BCA方法依靠銅離子進(jìn)行顯色反應(yīng),如果溶液中含有與銅離子反應(yīng)的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT、β-巰基乙醇,結(jié)果將受到很大程度的影響。同時(shí),BCA方法的檢測(cè)結(jié)果也會(huì)受到蛋白質(zhì)內(nèi)半胱氨酸,酪氨酸,色氨酸含量的影響。

2.    Bradford

該方法的原理是,帶負(fù)電的考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸相互作用??捡R斯亮藍(lán)在溶液中顯紅色,吸收峰在465nm處,當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后,其顯藍(lán)色,在595nm處有吸收峰。595nm處的吸光值與蛋白質(zhì)的濃度呈正比。

Bradford法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。樣品中巰基乙醇的濃度可高達(dá)1M,二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá)5mM。但受略高濃度的去垢劑影響。需確保SDS低于0.1%Triton X-100低于0.1%,Tween 20, 60, 80低于0.06%。

3.    UV280

這種方法是在280nm波長(zhǎng),直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過程非常簡(jiǎn)單,先測(cè)試空白液,然后直接測(cè)試蛋白 質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說,速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受 到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。

1)簡(jiǎn)易經(jīng)驗(yàn)公式

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor 

2)精確計(jì)算

通過計(jì)算OD280/OD260的比值,然后查表得到校正因子F,再通過如下公式計(jì)算最終結(jié)果:

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

其中d為測(cè)定OD值比色杯的厚度

D為溶液的稀釋倍數(shù)

4.    Lowry

     蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合,形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物,此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原,產(chǎn)生藍(lán)色化合         物,在一定條件下,利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。

     5、考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)法

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理,定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。

考馬斯亮藍(lán)G―250存在著兩種不同的顏色形式,紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合,在一定蛋白質(zhì)濃度范圍         內(nèi),蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律(Beer’s law)。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍(lán)色形式,最大光         吸收由465nm變成595nm,通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。

蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過程,約2min即可反應(yīng)*,呈現(xiàn)最大光吸收,并可穩(wěn)定1h,之后,蛋白質(zhì)―染料復(fù)         合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì)―染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù),使得在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高,在測(cè)定           溶液中含蛋白質(zhì)5µL/ml時(shí)就有0.275光吸收值的變化,比Lowry法靈敏4倍,測(cè)定范圍為10-100µg蛋白質(zhì),微量測(cè)定         法測(cè)定范圍是1-10µg蛋白質(zhì)。此反應(yīng)重復(fù)性好,精確度高,線性關(guān)系好。標(biāo)準(zhǔn)曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時(shí)稍有彎曲,         這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊,試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低,但直線彎曲程度很         輕,不影響測(cè)定。

此方法干擾物少,研究表明:NaCl,KCl,MgCl2,乙醇,(NH4)2SO4無干擾。強(qiáng)堿緩沖液在測(cè)定中有一些顏色         干擾,這可以用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照扣除其影響。Tris,乙酸,2―巰基乙醇,蔗糖,甘油,EDTA及微量的去污劑如                Triton X―100,SDS,玻璃去污劑有少量顏色干擾,用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照很容易除掉。但是,大量去污劑的存在對(duì)           顏色影響太大而不易消除。

 


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