在兩步法RT-qPCR中，RT反應(yīng)與PCR擴(kuò)增單獨(dú)進(jìn)行。首先，RNA添加到反應(yīng)混合物中，混合物包括逆轉(zhuǎn)錄酶和oligo-dTs (結(jié)合mRNA的poly-A尾巴)或隨機(jī)六聚體(或兩者都有)，合成cDNA。下一步，從管子中取出少量cDNA，置于一個(gè)新管中，作為PCR的模板與基因特定的引物一起混合。因?yàn)镽T反應(yīng)采用隨機(jī)啟動(dòng)或由oligo-dTs進(jìn)行啟動(dòng)，總RNA或總mRNA在RT步驟中被轉(zhuǎn)錄。

盡管這兩種方法都能得到最終的結(jié)果，但是每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點(diǎn)。

一步法RT-PCR 

一步法原理

原理 :   One step RT-PCR采用了一步反應(yīng)法完成整個(gè)RT-PCR反應(yīng)，即RNA-cDNA-qPCR反應(yīng)操作在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)過程中不需增加額外的步驟，就可完成整個(gè)RT-PCR反應(yīng)，具有方便、簡捷、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可適用于各種動(dòng)物、植物、病毒RNA的qPCR檢測。

優(yōu)點(diǎn) : 

1.簡便操作 

2.減少污染的可能性。（RT和qPCR反應(yīng)之間無需開管）。

3.另外由于得到的全部cDNA產(chǎn)物都一起經(jīng)PCR擴(kuò)增，使得一步法的靈敏度更高。

4.適用于定量PCR。

缺點(diǎn) :靈敏度要比兩步法低。不適合PCR初期條件的摸索，出了問題之后不能夠很好的找到原因

兩步法RT-PCR

兩步法原理

原理 :   與一步法RT-PCR相比，兩步法RT-PCR的缺點(diǎn)包括多個(gè)步驟延長了工作流程、增加樣本處理和操作步驟以及提高污染和結(jié)果變異的可能性。但是兩步法可以獲取大量的cDNA，同時(shí)可檢測單個(gè)RNA樣本中多個(gè)基因。

優(yōu)點(diǎn) : 靈敏度要比一步法高。在初期摸索PCR條件時(shí)，可以很容易找到問題所在。還有更為關(guān)鍵的一點(diǎn)是，做兩步法可以節(jié)約monney,特別是寶貴的反轉(zhuǎn)錄酶，把反轉(zhuǎn)錄體系分開做，一次的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以多次用來做PCR，非常適用于摸索PCR條件。

缺點(diǎn)：它更耗費(fèi)時(shí)間，且?guī)砦廴镜目赡苄愿?。RT步驟轉(zhuǎn)錄所有的RNA以相同的效率，選擇這種方法時(shí)，應(yīng)該考慮到啟動(dòng)會(huì)影響qPCR的結(jié)果。如果你在PCR初期建議用一步法。如果你的條件摸索成熟建議用兩步法