生物組織中，近紅外波長(zhǎng)較長(zhǎng)通常散射較少，水吸收較多。加利福尼亞大學(xué)研究人員Jun Zhu等展示了一個(gè)以2.1 μm為中心的光學(xué)相干斷層掃描（OCT）系統(tǒng)，其帶寬落在2.2 μm的水吸收光學(xué)窗口內(nèi)，用于嚙齒動(dòng)物大腦的體內(nèi)成像。成像結(jié)果顯示，使用2.1 μm光在顱骨中的OCT信號(hào)衰減實(shí)際上比1.3 μm更少，并且對(duì)多次散射拖尾也不太敏感。此外2.2 μm窗口能夠直接光譜OCT評(píng)估組織含水量。因此通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化，2.2 μm OCT將在低含水量組織（如骨）以及可能進(jìn)行廣泛平均以補(bǔ)償吸收損失的應(yīng)用中具有優(yōu)勢(shì)。文章以“Noninvasive, invivo rodent brain optical coherence tomography at 2.1 microns”為題發(fā)表于Optics Letters。
 

背景
 

以高分辨率更深入地觀察生物組織是生物光子學(xué)的基本目標(biāo)。然而，組織對(duì)光的散射和吸收限制了成像深度的發(fā)展。波長(zhǎng)較長(zhǎng)，散射系數(shù)（μ_s）降低，而吸收系數(shù)（μ_a）通常會(huì)增加。已知水局部地吸收落在位于1.05、1.3、1.7和2.2 μm附近的近紅外光學(xué)窗口內(nèi)。在光學(xué)相干斷層掃描（OCT）中，更傾向于使用長(zhǎng)波長(zhǎng)，即使水吸收更高，但散射更少，意味著檢測(cè)到的OCT信號(hào)比例更高，通常OCT使用的是1.3 μm窗口。1.7 μm雖然使用頻率較低，但它散射更低，并且在腦等組織的深度顯微鏡檢查中，衰減系數(shù)zuidi。由于光源限制和高吸水性，2.2 μm左右的光學(xué)窗口更少用于組織成像。與其他組織相比，骨是一種具有中等質(zhì)量含水量（12%）的生物組織，尚未探究過(guò)2.2 μm在體內(nèi)成像骨組織中是否具有優(yōu)勢(shì)。
 

本研究描述使用2.1 μm OCT進(jìn)行嚙齒動(dòng)物腦活體無(wú)創(chuàng)成像。發(fā)現(xiàn)在顱骨內(nèi)2.1 μm光的衰減實(shí)際上低于傳統(tǒng)的NIR窗口1.3 μm的衰減。進(jìn)一步使用2.1 μm透過(guò)完整顱骨對(duì)大鼠進(jìn)行皮質(zhì)OCT血管造影。除預(yù)期的多次散射光減少之外，更重要的是發(fā)現(xiàn)2.2 μm光譜窗口在體內(nèi)OCT中的額外優(yōu)勢(shì)：骨衰減更低，并可以直接光譜評(píng)估含水量。
 

2.1 μm OCT系統(tǒng)配置如圖1A所示。超連續(xù)譜光源（SuperK EXR20，NKT Photonics）經(jīng)兩個(gè)帶通濾波器（BBP-1615–2280，Spectrogon；FB2250–500，Thorlabs，Inc.）過(guò)濾后，通過(guò)反射準(zhǔn)直器（RC02，Thorlabs，Inc .）耦合到定制的50/50 SM2000光纖耦合器（Thorlabs，Inc.）中。在樣品臂中，光束由反射準(zhǔn)直器（RC04，Thorlabs，Inc.）準(zhǔn)直，經(jīng)2D檢流計(jì)（GVS002，Thorlabs，Inc.）掃描，通過(guò)掃描透鏡（LSM02或LSM03，Thorlabs，Inc.）聚焦到樣品上。在參考臂中，由一個(gè)改變參考功率的可調(diào)光闌和一個(gè)玻璃板補(bǔ)償樣品臂色散。來(lái)自樣品的反向散射光和來(lái)自參考鏡反射的光由光纖耦合器重新組合，并轉(zhuǎn)給定制的光譜儀。在光譜儀中，光束經(jīng)90°離軸拋物面鏡（MPD249-P01，Thorlabs，Inc.）準(zhǔn)直，由衍射光柵（刻線數(shù)600條/mm，Wasatch Photonics）散射，由150 mm有效焦距長(zhǎng)度消色差雙合對(duì)（Thorlabs，Inc .）聚焦，并由擴(kuò)展InGaAs線陣相機(jī)（SU1024LDH-2.2RT，Sensors Unlimited）檢測(cè)。相機(jī)由外部觸發(fā)并與2D檢流計(jì)掃描同步。數(shù)據(jù)通過(guò)幀抓取器（PCIe-1427，NationalInstruments Corp.）來(lái)收集。所有的硬件控制都是由一個(gè)定制的LabVIEW程序執(zhí)行的。光譜儀的光譜范圍為1990–2210 nm（圖1B）。在成像范圍的前半部分，靈敏度衰減小于5 dB（圖1C）。空氣中測(cè)得的軸向分辨率為18.6 μm（水中為14.0 μm）（圖1D）。獲得的樣品的1/e²橫向分辨率為16/32 μm（LSM02/LSM03）。4.3 mW入射功率和14.1 μs（47 kHz掃描速度）相機(jī)曝光時(shí)間下，最大靈敏度約84 dB。
 

系統(tǒng)噪聲源可通過(guò)改變攝像機(jī)捕獲的參考功率/光電子數(shù)來(lái)表征。對(duì)于線陣相機(jī)中的每個(gè)像素，總噪聲與檢測(cè)到的光電子數(shù)之間的關(guān)系用二次函數(shù)擬合，二階非線性項(xiàng)、一階線性項(xiàng)和常數(shù)項(xiàng)分別zhiding為過(guò)量噪聲、散粒噪聲和檢測(cè)器噪聲。當(dāng)相機(jī)以?。?.25Me^-）/大（12.5Me^-）滿阱容量（FWC）和短（14.1 μs，47 kHz）/長(zhǎng)（79.9 μs，12 kHz）曝光時(shí)間模式運(yùn)行時(shí)，分析了相對(duì)于散粒噪聲極限（SNL）的系統(tǒng)靈敏度（圖1E）。相對(duì)于SNL的最大系統(tǒng)靈敏度約為3.2%，受高探測(cè)器噪聲和光源過(guò)量噪聲的限制（圖1F）。



 

圖1 （A）2.1 μm OCT系統(tǒng)示意圖。（B）水中不同深度的光譜，參考光譜0 μm，（C，D）靈敏度衰減和軸向分辨率與色散補(bǔ)償深度的關(guān)系。（E）不同相機(jī)操作模式下，系統(tǒng)靈敏度與散粒噪聲極限的關(guān)系。（F）使用小FWC、長(zhǎng)EXP模式的不同噪聲源的貢獻(xiàn)。

  結(jié)果
 選擇Long-Evans（1-2號(hào)）和Sprague-Dawley（3-5號(hào)）大鼠（雄性，200-300g，Charles River），用異氟烷（1.5-2.5% v/v）在80%醫(yī)用空氣和20%氧氣的氣體混合物中麻醉，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中連續(xù)輸送。麻醉后，將大鼠固定在立體定向框架內(nèi)（Stoelting Co.）。小心取下頭皮，保持頭骨完好無(wú)損。用強(qiáng)力膠（Vibra-Tite）將蓋玻片固定在顱骨上，成像視野為2 × 2 mm²/2.5× 2.5 mm²。使用掃描透鏡LSM02/LSM03時(shí)，入射樣品功率為3.5/4.3 mW。對(duì)采集的條紋進(jìn)行重采樣、分配補(bǔ)償和傅里葉變換，得到復(fù)雜的OCT數(shù)據(jù)。為提供兩個(gè)光學(xué)窗口的內(nèi)在比較，不考慮OCT系統(tǒng)的性能，對(duì)強(qiáng)度（復(fù)數(shù)據(jù)的模平方）圖像進(jìn)行了深度相關(guān)噪聲背景和靈敏度下降的校正。基于分割的顱骨表面，每個(gè)亞位置內(nèi)的體積數(shù)據(jù)被展平，然后橫向平均以產(chǎn)生線輪廓。對(duì)于定量衰減系數(shù)分析，假設(shè)n_skull = 1.5和n_cortex = 1.33的折射率。
 在同一只大鼠中，通過(guò)順序獲得的1.3 μm和2.1 μm OCT顱骨和皮層的截面圖像（圖2A，B；n = 1.33），說(shuō)明了顱骨與大腦的衰減特征不同（圖2C）。然后將視場(chǎng)分為九個(gè)子區(qū)域進(jìn)行總衰減系數(shù)測(cè)量，共焦門控的計(jì)算如下:


 

其中z是深度，I（z，λ）表示OCT線輪廓，z₀（λ）是高斯光束瑞利范圍，z_cf（λ）表示光束腰的深度位置，設(shè)置為近似聚焦位置。OCT信號(hào)衰減用指數(shù)衰減項(xiàng)來(lái)描述，其中因子2表示雙程衰減，C是常數(shù)。比較了三只大鼠跨27個(gè)子區(qū)域的淺層皮層I（圖2C綠色陰影區(qū)域）中的衰減系數(shù)（圖2D）。two-way ANOVA確定統(tǒng)計(jì)顯著性。在顱骨中，由于散射較低，2.1 μm OCT信號(hào)比1.3 μm衰減得慢（P < 0.001），而在含水量高的皮層I中，2.1 μm的衰減系數(shù)更大（P < 0.001）。
 還注意到，在1990-2210 nm光譜范圍內(nèi)，吸水率顯著降低。如果散射得到適當(dāng)?shù)奶幚?，這一特征可以實(shí)現(xiàn)水體積分?jǐn)?shù)的光譜評(píng)估（與水含量成比例）。因此，將光譜分成7個(gè)子帶，中心波長(zhǎng)分別為2009、2037、2065、2094、2123、2154和2186nm，半峰全寬約為36nm。在成像視場(chǎng)的每個(gè)子區(qū)域中，背景和靈敏度滾降被校正，然后用共焦門控和單次散射的組合模型擬合局部平坦且橫向平均的OCT信號(hào)，


 這里，子帶之間的色焦移包含在z_cf （λ）中。衰減系數(shù)μ_t （λ）是散射衰減[μ_t,s（λ）= A（λ/500）^-b]的和，與μ_s不同，它包括多重散射效應(yīng)和水吸收[f_wμ_a,w （λ）]，其中b是散射功率，f_w是水的體積分?jǐn)?shù)。由于b依賴于樣本且先驗(yàn)未知，因此它被順序固定在從0到1.5的假設(shè)值，而C、f_w和A使用非線性最小二乘回歸對(duì)每個(gè)假設(shè)b進(jìn)行擬合。

圖2 使用（A）1.3μm和（B）2.1μm系統(tǒng)的大鼠頭蓋骨和皮質(zhì)的截面圖像。（C）組織OCT信號(hào)線輪廓，綠線界定顱骨和皮質(zhì)層Ⅰ的邊界（糖尿病，硬腦膜）。綠色陰影區(qū)域代表皮質(zhì)層Ⅰ的擬合范圍。（D）1-3號(hào)大鼠的平均組織衰減系數(shù)（平均標(biāo)準(zhǔn)偏差）。水平線表示由two-way ANOVA確定的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。
 

基于上面公式中的模型估計(jì)水體積分?jǐn)?shù)（f_w）（圖3）。為了首先評(píng)估該方法，進(jìn)行了離體模型實(shí)驗(yàn)。圖3A顯示了在25%（v/v）脂肪乳劑-20（IL-20）溶液（去離子水稀釋）的每個(gè)子帶中歸一化OCT信號(hào)的擬合。假設(shè)散射功率為0.5，擬合的總衰減系數(shù)（圖3B中的紅色）遵循整個(gè)光譜的吸水性（藍(lán)色虛線），表明含水量高。衰減主要由吸收[f_wμ_a,w（λ）]（藍(lán)色），而不是散射[μ_t,s（λ）= A（λ/500）^-b]（綠色）。由于假設(shè)的b值從0到1.5不等，IL-20溶液的估計(jì)f_w從94.1到91.5%不等（圖3C），接近94.3%[0.25 ×（ 1–22.7%）+0.75]的估計(jì)值，假設(shè)純IL-20中散射粒子的體積分?jǐn)?shù)為22.7%。圖3D顯示了歸一化的OCT信號(hào)在干式光學(xué)漫射器（WS-1，Ocean Optics）每個(gè)子帶中的擬合。假設(shè)散射功率為0.5，擬合的衰減系數(shù)（圖3E）在整個(gè)光譜范圍內(nèi)變化很小，表明含水量較低。由于假設(shè)的b值從0變化到1.5，估計(jì)的f_w在9.8-6.5%變化（圖3F）。擬合程序返回非物理負(fù)f_w值，以補(bǔ)償較大假設(shè)b的較大衰減變化。
 

給定這些在人體模型中的合理結(jié)果，然后我們?cè)隗w內(nèi)分割和分析大鼠顱骨和大腦皮層Ⅰ，應(yīng)用公式2中的模型，并假設(shè)在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)，水是顱骨和皮層中的主要吸收劑。在體內(nèi)分析中，最長(zhǎng)波長(zhǎng)子帶被丟棄，因?yàn)槠べ|(zhì)靈敏度差，受探測(cè)器量子效率的限制。大鼠顱骨（圖3G）和表層皮質(zhì)層I（圖3J）中的標(biāo)準(zhǔn)化體內(nèi)OCT信號(hào)的擬合表明，假設(shè)合理的散射功率為0.5，顱骨（圖3H）中頻譜的擬合總衰減系數(shù)比層I（圖3K）中的變化小，表明顱骨中的含水量較低。因此，體內(nèi)擬合（圖3I和3L）估計(jì)，皮質(zhì)層I與顱骨相比具有更高的水體積分?jǐn)?shù)（60-70%）（~ 20%）。



 

圖3 基于吸收的水體積分?jǐn)?shù)的光譜測(cè)量。（A，D，G，J）25%（v/v）IL-20溶液、干式光學(xué)擴(kuò)散器、顱骨和大腦（大鼠#2）的歸一化OCT子帶線輪廓。線條輪廓擬合（黑色實(shí)線）基于等式（2）。（B，E，H，K）波長(zhǎng)相關(guān)的擬合衰減系數(shù)（μ_t）（紅色）確定為擬合吸收衰減（f_wμ_a,w）（藍(lán)色）和擬合散射衰減（μ_t,s）（綠色）之和，假設(shè)散射功率b為0.5。純水吸收（μ_a,w）以供參考（藍(lán)色虛線）。（C、F、I、L）估計(jì)的水體積分?jǐn)?shù)（f_w）弱依賴于假設(shè)的b。

 

通過(guò)1.3 μm和2.1 μm系統(tǒng)獲得的大鼠頭蓋骨和皮質(zhì)的正面血管造影照片（圖4A，B；n = 1.33用于圖像顯示）是相似的。由于橫向分辨率（分別為15μm和16μm）非常接近，盡管2.1μm OCT系統(tǒng)的性能不是最佳的，但成像質(zhì)量顯著具有可比性。為評(píng)估多次散射，在對(duì)血管造影照片進(jìn)行局部平坦化和平均化之后，在圖4C中比較了來(lái)自1.3和2.1 μm處的橙色感興趣區(qū)域的歸一化顱骨血管線輪廓。在線輪廓中，血管管腔從60到30 μm，而多重散射拖尾開始于30μm左右?？傮w而言，在六個(gè)相似的ROI中，2.1 μm的拖尾幅度比1.3μm的低41±9%。此外，2.02–2.12μm子帶中血管造影的顱骨血管線輪廓相似（圖4D），表明水吸收不是主要影響因素。相反，2.1μm附近的較低散射可能解釋了較低的拖尾幅度。在2.1μm（圖4E–4G）對(duì)2號(hào)和4–5號(hào)大鼠進(jìn)行的深度彩色編碼正面血管造影顯示，硬腦膜上方的顱骨血管為藍(lán)色，皮質(zhì)血管為紅色（與硬腦膜的距離用n_skull= 1.5和n_cortex= 1.33計(jì)算）。表層皮質(zhì)脈管系統(tǒng)通過(guò)完整的顱骨被分解。



 

圖4 由（A）1.3 μm和（B）2.1 μm OCT系統(tǒng)獲得的大鼠頭蓋骨和皮質(zhì)的正面血管造影照片。（C）感興趣區(qū)域（橙色方框）中的顱骨血管線輪廓在2.1μm時(shí)顯示出尾部變小，這由ROI內(nèi)兩個(gè)波長(zhǎng)的橫截面血管造影照片所證實(shí)（插圖）。（D）ROI內(nèi)的子帶顱骨血管線輪廓在2.02-2.12μm之間相似，如ROI內(nèi)的截面血管造影照片所示（插圖）。（E–G）深度（到硬腦膜的距離）編碼的不同顱骨厚度的大鼠（大鼠#2和# 4–5）正面血管造影照片。請(qǐng)注意，在C和D中，假設(shè)折射率為n = 1.33，而在E–G中，n_skull = 1.5，n_cortex = 1.33。

 目前，由于探測(cè)器和光源噪聲，系統(tǒng)靈敏度非常有限。此外，并非所有使用的光學(xué)元件都針對(duì)2.1 μm進(jìn)行了優(yōu)化，這進(jìn)一步降低了靈敏度。例如，樣本臂中的掃描透鏡（LSM02/LSM03）有64%/42%的雙程損耗。定制光學(xué)系統(tǒng)將提高最大靈敏度。靈敏度也可以通過(guò)具有較低損耗和雙平衡檢測(cè)的掃頻源系統(tǒng)來(lái)提高。一個(gè)散粒噪聲受限的低損耗系統(tǒng)可以達(dá)到100 dB以上的靈敏度。對(duì)于顱骨含水量，膠原蛋白吸收的潛在作用值得進(jìn)一步研究。此外，60-70%的皮質(zhì)水體積分?jǐn)?shù)略低于預(yù)期。將來(lái)，加權(quán)吸水系數(shù)以說(shuō)明每個(gè)子帶的有限光譜寬度可以提高定量精度。關(guān)于散射功率的更好的先驗(yàn)信息也將提高精度。

  結(jié)論

 本文證明了一種在2.2 μm光譜窗口工作的新型OCT系統(tǒng)被證明可用于嚙齒動(dòng)物大腦的無(wú)創(chuàng)體內(nèi)成像。盡管由于水吸收較高，2.2 μm通常不用于生物成像，但本文的體內(nèi)研究顯示，對(duì)于骨這種低含水量的生物組織，2.1 μm實(shí)際上具有比1.3 μm更低的OCT衰減。盡管系統(tǒng)性能有限，但2.2 μm窗口的內(nèi)在優(yōu)勢(shì)得到了確認(rèn)，包括顱骨衰減更低、對(duì)多次散射的免疫力更強(qiáng)以及用光譜定量組織含水量的能力，在相關(guān)研究中可能發(fā)揮出意想不到的效果。

  參考文獻(xiàn)：Zhu, Jun , et al. "Noninvasive, in vivo rodent brain optical coherence tomography at 21 microns." Optics Letters 44.17(2019):4147.