轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1專用轉(zhuǎn)染試劑方法

原標(biāo)題：轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1專用轉(zhuǎn)染試劑方法-上海轉(zhuǎn)染生物科技有限公司

ZetaLife Advanced DNA RNA Transfection Reagent

儲(chǔ)存條件

4℃保存，拒絕反復(fù)凍融。

材料準(zhǔn)備

1.siRNA、miRNA或者小分子濃度20 uM /L。

2.質(zhì)粒DNA 濃度300 ng-2 ug/ul（注意：①溶解于無(wú)菌雙蒸水或超純水；②無(wú)內(nèi)毒素 ），推薦500ng/ul左右。

操作步驟

1.提前1天接種細(xì)胞：細(xì)胞匯合度在60-80%左右（根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)速度需調(diào)整起始密度），再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2. 核酸復(fù)合物制備：將核酸與轉(zhuǎn)染試劑按照1:1關(guān)系直接混合，用移液器吹吸10-15次混勻，室溫靜止10-15分鐘。

3.在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入核酸復(fù)合物：根據(jù)參考用量在細(xì)胞中加入核酸復(fù)合物，并輕輕混勻；細(xì)胞培養(yǎng)基里面可以含有血清。

4.細(xì)胞換液：轉(zhuǎn)染24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正常換液，懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中不用換液。

5.分析結(jié)果：質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，48-96小時(shí)檢測(cè)mRNA或蛋白表達(dá)。若進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選，則在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)左右加入適量的藥物進(jìn)行篩選。siRNA轉(zhuǎn)染后9小時(shí)熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，48-72小時(shí)檢測(cè)mRNA或蛋白表達(dá)。

注意事項(xiàng)

 1、質(zhì)粒DNA必須溶解于無(wú)菌雙蒸水或超純水，但不能溶解于提取試劑盒提供的Buffer。溶解于Buffer的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率會(huì)下降80%左右，甚至?xí)D(zhuǎn)染失敗。

 2、質(zhì)粒必須去除內(nèi)毒素，內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞將產(chǎn)生很大的細(xì)胞毒性，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降70%-80%左右，甚至導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失敗（推薦使用Qiagen、TIANGEN、Omega去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒）。

 3、復(fù)合物的制備過(guò)程中是不能用其他任何試劑對(duì)核酸或轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行稀釋，只需將核酸和轉(zhuǎn)染試劑兩者按1:1比例直接混合，如果進(jìn)行了稀釋會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失。

4、轉(zhuǎn)染試劑與核酸混勻后用移液器吹打10-15次，室溫孵育10-15分鐘后即可加入細(xì)胞培養(yǎng)板。

 5、轉(zhuǎn)染24小時(shí)后進(jìn)行正常換液，不能像Lipo2000一樣轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后換液。

 6、原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基里面不能含有雙抗培養(yǎng)基。

轉(zhuǎn)染操作流程圖