島津中國(guó)創(chuàng)新中心與北京陽(yáng)光諾和藥物研究股份有限公司和中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院合作，采用島津二維高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（2D-LC-QTOF），對(duì)頭孢美唑鈉熱降解的未知雜質(zhì)進(jìn)行了定性鑒定。

背景介紹

β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，主要包括頭孢菌素類(lèi)、青霉素類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)。頭孢美唑是第二代半合成的頭孢類(lèi)抗生素。2020版《中國(guó)藥典》，美國(guó)藥典（USP43）和日本藥典（JP17）都收錄了注射用頭孢美唑鈉。在注射用頭孢美唑鈉的質(zhì)量研究中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)熱比較敏感，頭孢美唑內(nèi)酯（cefmetazole lactone）和1-甲基-5-巰基四氮唑（1-methyl-5-mercaptotetrazolium）在高溫條件下均有明顯增加，主峰后出現(xiàn)3個(gè)明顯的未知雜質(zhì)。

某仿制藥和參比制劑樣品中實(shí)際檢出的未知雜質(zhì)含量超過(guò)了ICH Q3B規(guī)定的鑒定閾值（頭孢美唑日用最大劑量為4g，對(duì)應(yīng)的雜質(zhì)鑒定閾值為0.10%；部分樣品中如圖1所示雜質(zhì)3的量超過(guò)0.10%），故嘗試對(duì)注射用頭孢美唑鈉檢出的未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。圖1給出了注射用頭孢美唑鈉熱解樣品的一維（圖1A）和3種目標(biāo)雜質(zhì)（雜質(zhì)1-3）的二維（圖1B）紫外色譜圖。

圖1 注射用頭孢美唑鈉熱解樣品的一維(1A)和3種目標(biāo)雜質(zhì)（雜質(zhì)1-3）的二維(1B)色譜圖

解決方案

島津液相系統(tǒng)Nexera LC-40 +高分辨質(zhì)譜儀LCMS-9030

基于二維液相色譜-高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，采用中心切割技術(shù)將在一維中采用含非揮發(fā)性鹽的流動(dòng)相中分離得到的目標(biāo)未知物導(dǎo)入二維色譜，在二維色譜中采用質(zhì)譜兼容的揮發(fā)性流動(dòng)相，進(jìn)而采用高分辨質(zhì)譜對(duì)未知物進(jìn)行定性鑒定。一維色譜采用《中國(guó)藥典》中注射用頭孢美唑鈉的有關(guān)物質(zhì)檢查方法，流動(dòng)相中含不揮發(fā)的磷酸鹽和離子對(duì)試劑（四丁基氫氧化銨，TBAH）。二維色譜采用C18色譜柱，利用磷酸鹽在色譜柱上不保留，TBAH在高比例水相下不易洗脫等性質(zhì)，通過(guò)閥切換技術(shù)和改變流動(dòng)向比例等方法洗脫導(dǎo)入廢液，避免質(zhì)譜污染。

表1 頭孢美唑鈉中雜質(zhì)的分子式、加和離子和誤差

在結(jié)構(gòu)解析中，通過(guò)比較頭孢美唑鈉和未知降解雜質(zhì)的母離子及特征碎片離子的相關(guān)性，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的頭孢類(lèi)抗生素及雜質(zhì)的裂解規(guī)律，對(duì)頭孢美唑鈉中的三種未知雜質(zhì)進(jìn)行科學(xué)合理的定性分析。表1列出了三種未知雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和誤差。以雜質(zhì)2為例，在正模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖2A）：主要離子為m/z 488.0320，m/z 372.0160，m/z 505.0586。m/z 488.0320與m/z 505.0586相差17，可推斷m/z 505.0586為m/z 488.0320的[M+NH4]+峰。m/z 488.0320的二級(jí)產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖2B）。推測(cè)雜質(zhì)2的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律（見(jiàn)圖3），雜質(zhì)2可能為7-甲巰基頭孢美唑。同時(shí)，7-甲巰基頭孢美唑也是一種常見(jiàn)的頭孢美唑雜質(zhì)。

圖2 雜質(zhì)2在正模式下的掃描離子(2A)和m/z 488.0320的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖(2B)

圖3 雜質(zhì)2可能的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜裂解規(guī)律

結(jié)論

本研究對(duì)頭孢美唑中的3種未知雜質(zhì)進(jìn)行了科學(xué)合理的定性分析，對(duì)于頭孢美唑的質(zhì)量控制及安全性評(píng)價(jià)具有重要意義。本分析方法適用于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中未知雜質(zhì)的分離和定性，具有很強(qiáng)的通用性，同時(shí)可對(duì)化學(xué)藥物、天然產(chǎn)物、多組分生化藥等復(fù)雜組成體系進(jìn)行定性鑒別，從而提供可靠的質(zhì)量控制分析方法。

本工作基于創(chuàng)新中心搭建的專(zhuān)屬性中心切割二維反相色質(zhì)譜聯(lián)用分析平臺(tái)（2D-LC-QTOF）和開(kāi)發(fā)的《抗生素雜質(zhì)數(shù)字化標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)》，該數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的一般雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)的色譜和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，還登錄了抗生素相關(guān)雜質(zhì)的液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜分析方法。該分析平臺(tái)不僅為企業(yè)客戶(hù)大大降低了企業(yè)研發(fā)成本，同時(shí)也為企業(yè)的工藝改進(jìn)、劑型研發(fā)、品質(zhì)提升等方面提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)：

《采用二維高效色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)注射用頭孢美唑鈉的未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析》《中國(guó)藥學(xué)雜志》中圖分類(lèi)號(hào)：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A  文章編號(hào)：1001-2494(2022) 08-0645-06 doi: 10.11669/cpj.2022.08.009