前言

自然殺傷（NK）細(xì)胞是起源于淋巴的細(xì)胞毒性先天免疫細(xì)胞。1973年，人們發(fā)現(xiàn)了一種非T非B淋巴細(xì)胞亞群可有效殺死被抗體識別的細(xì)胞，隨后被描述為“null”殺傷細(xì)胞。兩年后，有報道稱這種細(xì)胞能夠殺死各種類型的腫瘤細(xì)胞，并創(chuàng)造了術(shù)語“自然”殺傷細(xì)胞。NK細(xì)胞不僅在抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮作用，而且在抵抗微生物感染方面也發(fā)揮作用。

NK細(xì)胞表達(dá)多種激活和抑制受體，這些受體介導(dǎo)的信號之間的平衡決定了NK細(xì)胞激活的結(jié)果。NK細(xì)胞在沒有預(yù)先致敏的情況下殺死癌細(xì)胞的能力在腫瘤免疫監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。以 NK 細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療領(lǐng)域已經(jīng)到了一個激動人心的關(guān)頭。雖然這些療法還沒有取得與過繼性 T 細(xì)胞療法同樣程度的臨床成功，但是早期的令人鼓舞的結(jié)果使 NK 細(xì)胞療法的開發(fā)熱情越來越高。

NK細(xì)胞生物學(xué)

NK細(xì)胞是個被鑒定的先天性淋巴細(xì)胞（ILC）亞型，能對病毒感染和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生多種效應(yīng)器功能，主要是細(xì)胞殺傷和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。NK細(xì)胞和其他ILC家族成員（—1型ILC（ILC1s）、ILC2s和ILC3s）與B細(xì)胞和T細(xì)胞來源于相同的淋巴祖細(xì)胞。NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性使它們在功能上與CD8+T細(xì)胞尤為相似，而ILC1、ILC2和ILC3群體的細(xì)胞因子生成模式將這些細(xì)胞分別對應(yīng)CD4+T細(xì)胞的TH1、TH2和TH17亞群。

NK細(xì)胞的兩個典型的亞群是CD56brightCD16-和CD56dimCD16+群體。CD56bright細(xì)胞在外周血中的數(shù)量較少（循環(huán)中90%的NK細(xì)胞是CD56dim），而組織中的NK細(xì)胞主要是CD56bright。CD56bright NK細(xì)胞是強(qiáng)有力的細(xì)胞因子產(chǎn)生者，除非受到促炎性細(xì)胞因子如IL-15的刺激，否則細(xì)胞毒性較弱。相比之下，CD56dim NK細(xì)胞群可介導(dǎo)感染細(xì)胞和惡性細(xì)胞的連續(xù)殺傷，主要通過包含顆粒酶B和穿孔素的預(yù)先組裝的溶細(xì)胞顆粒在免疫突觸中的胞吐，終誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。

NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制

NK細(xì)胞具有多種功能，可以限制癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散。在TME先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎性趨化因子的指導(dǎo)下，循環(huán)NK細(xì)胞可被招募到腫瘤發(fā)生的部位。CXCR3–CXCR4、CX3CR1和CCR3–CCR5是NK細(xì)胞亞群差異表達(dá)的主要趨化受體。

進(jìn)入TME后，NK細(xì)胞可以通過“丟失自我”機(jī)制殺死癌細(xì)胞。許多癌細(xì)胞下調(diào)MHC I分子的表達(dá)，以逃避細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的檢測，然而NK細(xì)胞能夠識別和響應(yīng)這種缺失的自我表型的細(xì)胞，終導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解。因此，在T細(xì)胞不能識別MHC I下調(diào)癌細(xì)胞的情況下，NK細(xì)胞具有治療潛力。

 ADCC是NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷癌細(xì)胞的另一個關(guān)鍵機(jī)制。除了直接誘導(dǎo)細(xì)胞毒性外，NK細(xì)胞還通過產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子（包括IFN-γ和TNF）對轉(zhuǎn)化細(xì)胞作出反應(yīng)。

NK細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)抑制

關(guān)于ICI的研究主要集中在抗腫瘤T細(xì)胞的去抑制，這種治療模式增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性也引起了相當(dāng)大的關(guān)注。例如，人源化抗NKG2A單克隆抗體monalizumab目前正在對多種癌癥患者進(jìn)行單藥試驗(yàn)，或與其他免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，臨床前數(shù)據(jù)表明這種藥物能顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

TIGIT是另一種由NK細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)的抑制性受體，其配體在人類腫瘤浸潤的NK細(xì)胞上過表達(dá)。在一些小鼠模型中，TIGIT抑制逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞衰竭并促進(jìn)NK細(xì)胞依賴性抗腫瘤免疫。已經(jīng)設(shè)計(jì)了一些積極的臨床試驗(yàn)來測試單獨(dú)抗TIGIT藥物以及與其他免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用的有效性和/或安全性。（如NCT03119428、NCT04150965、NCT04047862、NCT04256421、NCT03563716和NCT04294810）

另外還有LAG-3和TIM-3，來自小鼠NK細(xì)胞研究的數(shù)據(jù)表明LAG-3在介導(dǎo)對腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性方面起著積極作用；肺腺癌患者NK細(xì)胞上TIM-3表達(dá)增加預(yù)示著不良預(yù)后，體外抑制這種NK細(xì)胞的TIM-3增強(qiáng)了其細(xì)胞毒性和IFNγ的產(chǎn)生。目前，多個臨床試驗(yàn)正在對各種癌癥患者進(jìn)行LAG-3和TIM-3抑制劑的試驗(yàn)，（包括NCT01968109、NCT04150965、NCT04140500、NCT03625323、NCT0331142、NCT03066648、NCT03489343、NCT03680508和NCT04139902等）。

其它基于NK細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)還包括CD96、 Siglec-7/9、CD200R、CD47、CTLA-4、PD-1和B7-H3，將這些檢查點(diǎn)結(jié)合起來進(jìn)行協(xié)同抗腫瘤反應(yīng)是未來充分發(fā)揮NK細(xì)胞殺傷腫瘤作用的方向。

過繼性NK細(xì)胞療法

異基因外周血NK細(xì)胞只是治療性NK細(xì)胞眾多潛在來源之一。NK細(xì)胞約占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%，而臍帶血（UCB）中的NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的30%；因此，UCB是治療效應(yīng)NK細(xì)胞的可靠來源。UCBNK細(xì)胞的治療效果目前正在一些臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評估（如NCT01619761和NCT02280525）。

克隆性NK細(xì)胞系，如NK-92、KHYG-1和YT細(xì)胞，是異基因NK細(xì)胞的替代來源，NK-92細(xì)胞系已在臨床試驗(yàn)中得到廣泛測試。然而，這些細(xì)胞是非整倍體，因此遺傳不穩(wěn)定，這就要求它們在輸注前接受輻照。輻照的NK-92細(xì)胞被觀察到可以殺死癌癥患者的腫瘤細(xì)胞。

此外，臨床上正在對來自多種來源的干細(xì)胞衍生NK細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行檢測，包括來自UCB干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC）的NK細(xì)胞產(chǎn)物。將成年細(xì)胞重新編程為多能干細(xì)胞，以使其分化為NK細(xì)胞并擴(kuò)展生成終產(chǎn)物，是基于iPSC的方法的一個特征。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谡心佳夯驅(qū)嶓w癌患者，以測試這些現(xiàn)成的iPSC衍生NK細(xì)胞的安全性。

適應(yīng)性NK細(xì)胞是治療性NK細(xì)胞的另一個新興來源。適應(yīng)性NK細(xì)胞是一種自然發(fā)生的細(xì)胞群，在HCMV感染或再激活后在人類中擴(kuò)增。HCMV UL40衍生肽抗原-HLA-E復(fù)合物與NK細(xì)胞上NKG2C之間的相互作用，導(dǎo)致NKG2ChiCD57+NK細(xì)胞增殖，NKG2ChiCD57+NK細(xì)胞下調(diào)參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的某些蛋白質(zhì)，包括PLZF、SYK和FcεRIγ。適應(yīng)性NK細(xì)胞具有一些效應(yīng)器特性，包括增強(qiáng)的ADCC、增強(qiáng)的細(xì)胞因子反應(yīng)和對MDSCs和Treg細(xì)胞免疫抑制作用的固有抵抗。目前，三項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在評估這些適應(yīng)性NK細(xì)胞對各種癌癥患者的療效。

細(xì)胞因子誘導(dǎo)記憶樣（CIML）NK細(xì)胞是異基因細(xì)胞治療的另一種選擇，與其他類型的NK細(xì)胞產(chǎn)品相比具有優(yōu)勢。CIML-NK細(xì)胞在體外通過IL-12、IL-15和IL-18的短暫啟動，產(chǎn)生對細(xì)胞因子反應(yīng)增強(qiáng)的NK細(xì)胞，并激活持續(xù)數(shù)周至數(shù)月的受體刺激。將這些CIML-NK細(xì)胞輸注到攜帶AML異種移植物的小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤作用并顯著延長存活時間。在I期試驗(yàn)中，CIML NK細(xì)胞具有良好的安全性，在44%的可評估AML患者（4/9）體內(nèi)擴(kuò)增并誘導(dǎo)病情緩解。

CAR-NK

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細(xì)胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-NK細(xì)胞免疫療法比CAR-T細(xì)胞免疫療法更安全，而且NK細(xì)胞的安全性已在一些臨床領(lǐng)域得到驗(yàn)證。例如，一些I/II期試驗(yàn)顯示，同種異體NK細(xì)胞輸注耐受性良好，不會引起GVHD和明顯的毒性。因此，NK細(xì)胞是一種適應(yīng)性更強(qiáng)的CAR載體，而不僅僅局限于自體細(xì)胞。

NK細(xì)胞上表達(dá)的功能性CAR分子由三部分組成：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)的信號結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由一個信號肽和識別抗原的單鏈抗體片段（scFv）組成，一段鉸鏈區(qū)將這個結(jié)構(gòu)連接到跨膜區(qū)，它也在細(xì)胞內(nèi)連接到包含激活信號的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。成功的CAR設(shè)計(jì)是通過仔細(xì)的設(shè)計(jì)和功能測試相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。
 

載體骨架和啟動子

載體骨架包含表達(dá)CAR所需的所有元件，如啟動子、polyA信號和轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段。

啟動子的選擇直接影響到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。目前，對不同啟動子在NK細(xì)胞系中的CAR表達(dá)和功能的比較只有一次報道，而對原代NK細(xì)胞沒有比較數(shù)據(jù)。就這一次單個報告來看，還不能確定CAR-NK細(xì)胞的啟動子。

目前關(guān)于CAR-NK細(xì)胞的報道顯示，多種啟動子被用于驅(qū)動CAR的表達(dá)，無論是細(xì)胞系來源的還是原代NK細(xì)胞。在原代CAR-NK和CAR-NK細(xì)胞系中，病毒啟動子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成性活性啟動子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。

信號肽

在信號肽中存在著巨大的異質(zhì)性，這直接轉(zhuǎn)化為不同水平的蛋白質(zhì)分泌效率。對于CAR-NK和CAR-T細(xì)胞，還沒有確定信號肽的比較研究。目前，CD8a-SP是原代NK細(xì)胞常用的信號肽序列（16%，71%的研究中未公布）和NK細(xì)胞系的免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽（29%）。

單鏈抗體

單鏈抗體片段是CAR的腫瘤抗原結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域?qū)Q定CAR-NK細(xì)胞的特異性和功能。

由于單鏈抗體不是抗體的天然形式，因此重鏈和輕鏈的順序是人工確定的。到目前為止，對于CAR-NK設(shè)計(jì)，大多數(shù)更喜歡VH-VL方向，而不是VL-VH方向。

Fujiwara等人證明重鏈和輕鏈的順序不影響T細(xì)胞上抗KDR CAR的表達(dá)水平。

此外，細(xì)胞可以配備多個單鏈抗體，從而擴(kuò)大CAR效應(yīng)細(xì)胞的抗原識別能力。在這里，有多種選擇：CARs可以用雙元件的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)兩個CAR結(jié)構(gòu)的表達(dá)；或者將兩個單鏈抗體融合在一個結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生串聯(lián)單鏈抗體的“單柄”CAR。雖然這些技術(shù)已用于生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞，但CAR-NK細(xì)胞仍未知。

目前大多數(shù)臨床CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)都使用了來自小鼠抗體的單鏈抗體，這增加了抗小鼠IgG細(xì)胞宿主抗移植物病的風(fēng)險，這個問題可以通過人源化或篩選全人抗體避免。幸運(yùn)的是，在迄今為止數(shù)量有限的CAR-NK臨床試驗(yàn)中，沒有發(fā)現(xiàn)與抗CAR免疫反應(yīng)相關(guān)的重大副作用。

連接區(qū)

重鏈和輕鏈之間的連接區(qū)有助于穩(wěn)定單鏈抗體的構(gòu)象，過短會導(dǎo)致多聚體的形成，過長可能導(dǎo)致水解或降低VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)聯(lián)。對于CAR-NK細(xì)胞，五肽GGGGS的多聚體應(yīng)用十分廣泛，通常為3個重復(fù)。另一個旨在增強(qiáng)蛋白水解穩(wěn)定性的連接體是Whitlow“218”連接體：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。

目前，雖然大多數(shù)CAR-NK研究沒有提供連接細(xì)節(jié)，但已有的研究報道中，有22項(xiàng)使用了G4S連接，有2項(xiàng)應(yīng)用了218連接。

鉸鏈區(qū)

鉸鏈區(qū)是連接單鏈抗體單位和跨膜結(jié)構(gòu)域的CAR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū)，它通常維持效應(yīng)細(xì)胞中穩(wěn)健的CAR表達(dá)和活性所需的穩(wěn)定性。大多數(shù)CAR-NK構(gòu)建使用CD8α或CD28胞外結(jié)構(gòu)域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區(qū)。
 

鉸鏈區(qū)的類型和長度對CAR的功能活動有重要影響。但是目前大多數(shù)信息全來自CAR-T領(lǐng)域，能否直接轉(zhuǎn)化為CAR-NK還有待證明。

在CD28和CD8α鉸鏈區(qū)之間的直接比較中，發(fā)現(xiàn)CD28更有可能促進(jìn)CAR分子的二聚化，因此，CD28鉸鏈區(qū)的CAR產(chǎn)生的激活刺激更強(qiáng)。雖然這可能是有益的，但也可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的副作用。

IgG為基礎(chǔ)的鉸鏈區(qū)也廣泛應(yīng)用于CAR結(jié)構(gòu)。基于IgG鉸鏈區(qū)的一個主要優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)的靈活性，該結(jié)構(gòu)通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3結(jié)構(gòu)域組成。鉸鏈區(qū)的長度可以調(diào)節(jié)以適應(yīng)抗原識別，但研究發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)越短，細(xì)胞因子的產(chǎn)生越高，CAR-T細(xì)胞增殖越快，體內(nèi)持久性和抗腫瘤效果越好。

對于CAR-NK細(xì)胞，大多數(shù)研究在原代NK細(xì)胞（16/35）和CAR-NK細(xì)胞系（41/72）中均采用CD8α鉸鏈區(qū)。其它使用的鉸鏈區(qū)包括CD28、IgG Fc結(jié)構(gòu)域和DAP12。

跨膜結(jié)構(gòu)域

跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域連接CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)激活信號結(jié)構(gòu)域，CAR-NK常用的TM部分來自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。
 

TM結(jié)構(gòu)域的選擇影響了CAR結(jié)構(gòu)在細(xì)胞功能上的活化程度。通常在NK細(xì)胞上表達(dá)的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM會導(dǎo)致更多的CD107a脫顆粒和更高的細(xì)胞毒性，因此，TM的具體來源將決定CAR-NK的活性。

TM結(jié)構(gòu)域的一個重要方面是，TM區(qū)域應(yīng)遵循T細(xì)胞或NK細(xì)胞上跨膜蛋白的蛋白質(zhì)自然取向（N端到C端順序）。NKG2D雖然是一種強(qiáng)大的NK細(xì)胞激活劑，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜區(qū)。

目前，CD8α和CD28修飾的TM在原代CAR-NK細(xì)胞中常見，而CD28是CAR-NK細(xì)胞系的TM區(qū)域。

CAR-NK激活信號

CAR的細(xì)胞內(nèi)激活信號的數(shù)量決定了其屬于哪一“代”CAR。

代CAR-NK細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞一樣，只含有CD3ζ信號。第二代和第三代CAR-NK分別攜帶一個和兩個額外的共刺激信號，共刺激分子通常來源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相關(guān)受體家族（2B4）。到目前為止，公布的CAR-NK臨床試驗(yàn)采用了第二代CAR-NK構(gòu)建，該構(gòu)建通過加入IL-15表達(dá)和誘導(dǎo)Caspase9增強(qiáng)活性。

目前大多數(shù)CAR結(jié)構(gòu)依賴于CD3ζ鏈信號域，強(qiáng)烈的激活信號對于誘導(dǎo)有效的抗腫瘤反應(yīng)很重要，但也可能導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的快速衰竭。因此，共刺激域的組合可用于校準(zhǔn)所需的免疫細(xì)胞反應(yīng)。與基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表現(xiàn)出更快的效應(yīng)器特征，誘導(dǎo)更高水平的IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α。然而，這種強(qiáng)烈的共刺激信號也會導(dǎo)致活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD）。

相比較，4-1BB-CD3ζ信號優(yōu)先誘導(dǎo)記憶相關(guān)基因和持續(xù)的抗腫瘤活性。原因可能是4-1BB結(jié)構(gòu)域改善了CD28結(jié)構(gòu)域引起的T細(xì)胞耗竭。
 

如上圖所示，在CAR-NK細(xì)胞系和原代CAR-NK細(xì)胞的研究中，CD3ζ幾乎被普遍用作主要的激活域，其中大約一半攜帶一個額外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代結(jié)構(gòu)，CD28/4-1BB/CD3ζ的組合是常用的。

NK細(xì)胞定向接合器

各種免疫逃避機(jī)制限制了NK細(xì)胞在體內(nèi)與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合程度，是實(shí)現(xiàn)廣泛有效的NK細(xì)胞治療的主要障礙。為了增強(qiáng)腫瘤浸潤性NK細(xì)胞的自然細(xì)胞毒性，許多研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)在開發(fā)一些分子，使這些細(xì)胞以抗原特異性的方式與腫瘤細(xì)胞接觸。這些分子通常是由多個抗體（通常為單鏈抗體）組成的雙特異或三特異性接合器，使得一個結(jié)構(gòu)域針對NK細(xì)胞激活受體，另一個與特定腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合。例如，一種由兩個單鏈抗體組成的三特異性殺傷接合器（TriKE），一個針對NK細(xì)胞上的CD16，另一個針對AML細(xì)胞的CD33，通過IL-15結(jié)構(gòu)域連接，該結(jié)構(gòu)域旨在增強(qiáng)NK細(xì)胞的存活和增殖。

這種抗CD16、IL-15和抗CD33 TriKE（GTB-3550）增強(qiáng)了NK細(xì)胞效應(yīng)器功能的其他幾個重要方面，在臨床前研究中觀察到了改善遷移能力、增加連續(xù)殺傷和縮短殺傷時間。

在臨床前研究中，其他幾種NKCE分子也被證明具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用。AFM13靶向淋巴瘤相關(guān)抗原CD30和CD16a，后者是NK細(xì)胞表達(dá)的CD16的跨膜形式。AFM13在AACR 2022中表現(xiàn)驚艷，AFM13+臍血來源NK細(xì)胞治療，緩解率達(dá)到62%。

展望

自然殺傷細(xì)胞是一組抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，具有不受MHC限制的細(xì)胞毒性、產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色。一些癌癥的發(fā)生與功能失調(diào)的NK細(xì)胞有關(guān)。因此，修復(fù)這種NK細(xì)胞可能是抗腫瘤免疫治療的一個潛在選擇。這種修復(fù)的一種方法是抑制免疫檢查點(diǎn)，即癌細(xì)胞通過控制免疫細(xì)胞表面的抑制受體進(jìn)行免疫逃逸。

利用NK細(xì)胞與抗體、免疫細(xì)胞接合器、CARs和其它檢查點(diǎn)抑制劑的組合方法進(jìn)行試驗(yàn)，這些方法旨在調(diào)節(jié)抑制檢查點(diǎn)和增強(qiáng)抗腫瘤能力。目標(biāo)是找到一種基于NK細(xì)胞的治療策略，這種策略是安全的，并且具有廣泛臨床應(yīng)用所需的確切療效。

來源：生物藥學(xué)科普

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