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瑋馳分享丨快速了解“單細(xì)胞技術(shù)”與“傳統(tǒng)流式技術(shù)”檢測胞內(nèi)蛋白的區(qū)別

來源:上?,|馳儀器有限公司   2022年08月30日 14:54  

IsoPlexis的單細(xì)胞蛋白組技術(shù)不僅可以“向外看”---檢測培養(yǎng)單個細(xì)胞胞外分泌的細(xì)胞因子;也可以“向內(nèi)看”---檢測單細(xì)胞水平胞內(nèi)蛋白。使用細(xì)胞內(nèi)蛋白組學(xué)相關(guān)panel可以在幾天內(nèi)揭示腫瘤靶向治療中信號通路變化。

在腫瘤治療耐藥性研究中,研究人員經(jīng)常通過基因組研究來了解腫瘤的微環(huán)境和信號通路,但腫瘤中一些功能的適應(yīng)性變化沒有引起基因?qū)用娴母淖?,所以僅憑基因組學(xué)研究很難提供腫瘤治療耐藥性機(jī)制的完整信息。單細(xì)胞胞內(nèi)蛋白組解決方案是研究腫瘤信號通路和治療耐藥性基礎(chǔ)的關(guān)鍵工具,幫助研究人員進(jìn)行完整的功能表征。

 

檢測胞內(nèi)蛋白的區(qū)別

傳統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白方法之一是流式細(xì)胞術(shù),進(jìn)行表面抗體標(biāo)記分型細(xì)胞再進(jìn)行細(xì)胞固定破膜,讓熒光抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記胞內(nèi)磷酸化蛋白。這聽起來不難,但實(shí)際有好幾個需要考慮的實(shí)驗(yàn)步驟。

首先,固定破膜液的選擇會影響抗體標(biāo)記的效果,還要兼顧表面標(biāo)記不受胞內(nèi)熒光抗體的影響。其次是抗體的挑選跟配色方案,不是所有經(jīng)過驗(yàn)證的抗體都可以不受固定破膜液的影響,標(biāo)記到胞內(nèi)磷酸化蛋白;抗體上帶的熒光染料也有可能被固定液破壞導(dǎo)致信號不足。如果一次想看好幾個胞內(nèi)磷酸化蛋白,還要考慮抗體之間的特異性不跟其它蛋白交叉反應(yīng),以及熒光染料之間的熒光補(bǔ)償問題。倘若還要考慮表面蛋白標(biāo)記分型的抗體,整個流式抗體配色方案就要思考設(shè)計(jì)一整天,更不用說實(shí)驗(yàn)后還得根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果優(yōu)化整個方案了,幾次實(shí)驗(yàn)下來花費(fèi)的時間可能就是幾周了。總結(jié)以上幾點(diǎn),一般流式檢測胞內(nèi)磷酸化蛋白靶標(biāo)只能是2-5種。

IsoPlexis單細(xì)胞胞內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)組解決方案針對每個芯片中500-1500個單個細(xì)胞,分析每個細(xì)胞多達(dá)15種磷酸化蛋白。經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證的抗體組合,通過這些信號通路中關(guān)鍵磷酸化蛋白的表征研究細(xì)胞信號通路,研究整個信號網(wǎng)絡(luò)的變化,并揭示關(guān)鍵的適應(yīng)性耐藥途徑。IsoPlexis系統(tǒng)還是全自動化運(yùn)行的,單細(xì)胞懸液樣本加入微流控芯片后,細(xì)胞在芯片中進(jìn)入單細(xì)胞微室、裂解單細(xì)胞,微室為磷酸化蛋白檢測提供了一個更大的捕獲區(qū)域(圖1),單細(xì)胞的分離、裂解,以及細(xì)胞內(nèi)蛋白的檢測都由儀器自行完成。
 

圖1:以流式為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法與單細(xì)胞胞內(nèi)蛋白組技術(shù)對比
 

需要特別指出的是流式配色panel設(shè)計(jì)是一個非常復(fù)雜的過程。使用IsoPlexis單細(xì)胞檢測系統(tǒng)避免了復(fù)雜流式配色panel的設(shè)計(jì),系統(tǒng)使用條形碼抗體,避免了檢測過程中不同蛋白之間的相互干擾。IsoPlexis進(jìn)行了相關(guān)的方法開發(fā),配套的芯片panel已被驗(yàn)證和優(yōu)化,適用于不同的應(yīng)用方向(圖2),不需要研究人員進(jìn)行優(yōu)化,可立即使用 。這意味著研究人員不需要耗費(fèi)可能長達(dá)數(shù)個月的時間去建立方法,開發(fā)panel,再進(jìn)行實(shí)驗(yàn);只需要幾天內(nèi)就可以得到結(jié)果。

 

圖2:經(jīng)過驗(yàn)證的panel

 

應(yīng)用案例之一:在腫瘤靶向治療的過程中,一旦對治療產(chǎn)生耐藥性,腫瘤就會復(fù)發(fā),必須開發(fā)更好的治療方案。治療耐藥性的表征對于創(chuàng)建有效治療方案至關(guān)重要;因?yàn)槟[瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性,定義和測量每個腫瘤細(xì)胞對信號通路的貢獻(xiàn)至關(guān)重要。通過同時對不同信號通路中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的多達(dá)15個磷酸化蛋白進(jìn)行檢測,可以幫助分析多重蛋白之間關(guān)聯(lián)性,評估信號通路是否被抑制,或者新的信號通路是否建立,進(jìn)一步得到完整的信號通路網(wǎng)絡(luò)信息,評估治療方案的耐藥性,以確定有效的靶點(diǎn)(圖3)。

另一篇應(yīng)用在Cancer Cell的一篇文章中:利用IsoPlexis的單細(xì)胞胞內(nèi)蛋白組技術(shù),研究人員能夠通過分析信號通路中不同磷酸化蛋白的協(xié)同關(guān)系評估膠質(zhì)細(xì)胞瘤治療耐藥性的產(chǎn)生。研究表明,耐藥性可以通過一種非遺傳(適應(yīng)性)機(jī)制進(jìn)行,該機(jī)制在單一抑制劑用藥后的幾天內(nèi)被激活(圖3)。
 

圖3:用藥后,胞內(nèi)信號通路的改變

 

單一藥物治療后,測量到腫瘤胞內(nèi)功能的適應(yīng)性變化提示研究者進(jìn)行聯(lián)合治療,即同時使用多種靶向藥物進(jìn)行治療,應(yīng)對單一藥物治療帶來的耐藥性問題。結(jié)果顯示多藥聯(lián)用可以有效阻止腫瘤生長(圖4)。這種單細(xì)胞分析方法為設(shè)計(jì)更有效的腫瘤聯(lián)合治療策略提供了可能。
 

圖4:多種藥物聯(lián)用,評估有效治療方案


IsoPlexis單細(xì)胞蛋白質(zhì)組檢測技術(shù)相比傳統(tǒng)方法省去了流式實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì),全自動儀器節(jié)省了實(shí)驗(yàn)人力物力,更重要的是節(jié)省寶貴的樣本,使用單細(xì)胞胞內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)組芯片針對15種磷酸化蛋白捕獲相對完整的信號通路網(wǎng)絡(luò)信息。另外還有單細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組及多重細(xì)胞因子蛋白質(zhì)組芯片,3款芯片聯(lián)用可以更地了解免疫細(xì)胞對不同治療方案的功能性反應(yīng)。
 

文章來源:IsoPlexis

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