材料與儀器：細(xì)胞、TBS抽提緩沖液、離心管

實(shí)驗(yàn)步驟：

步驟1：根據(jù)樣品類型，從下列方法中選一個(gè)作為步驟1進(jìn)行操作。

(1) 細(xì)胞樣品

① 單層培養(yǎng)的細(xì)胞

以用冰預(yù)冷的 TBS 將單層細(xì)胞洗滌2次，用刮棒把細(xì)胞刮入約0.5ml 的 TBS 中，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到冰浴的離心管中，用1ml TBS沖洗培養(yǎng)皿，并入離心管中的細(xì)胞懸液。于 4℃ 以1500g離心10分鐘以收獲細(xì)胞。用5~10倍體積經(jīng)冰預(yù)冷的 TBS 重懸細(xì)胞并再度離心。用TE ( pH 8.0）重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度為 5x107 細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)移至一個(gè)三角燒瓶中（1ml 細(xì)胞懸液用 50ml 燒瓶；2ml 則用100ml燒瓶；余類推）。每毫升細(xì)胞懸液加入10ml抽提緩沖液，在37℃孵育1小時(shí)，隨后進(jìn)行步驟2。

抽提緩沖液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0

0.1 mol/L EDTA，pH 8.0

20 ug/ml 胰 RNA 酶

0.5% SDS

② 懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞

于 4℃ 以 1500 g 離心 10 分鐘以收獲細(xì)胞。用與原培養(yǎng)液等體積的經(jīng)過冰預(yù)冷的 TBS 重懸細(xì)胞，再次離心收獲細(xì)胞并重復(fù)洗滌步驟。用 pH 8.0 的 TE 重懸細(xì)胞使密度為 5x107 細(xì)胞/ml。將懸液轉(zhuǎn)移至大小適當(dāng)?shù)臒恐?，依前聽述加入抽提緩沖液并孵育。

(2) 組織標(biāo)本

將剛切制的組織碎塊放到盛有液氮的 Waring 絞切器的不銹鋼杯中，以最高速度絞切至組織粉碎成為粉末。待液氮蒸發(fā)，將組織碎末一點(diǎn)一點(diǎn)地加入到盛有近 10 倍體積抽提緩沖液（如前）的燒杯中。使粉末分散在抽提緩沖液的表面，面后振搖燒杯使粉末浸沒。待其*分散于溶液中后，將該溶液轉(zhuǎn)移至 50 ml 離心管中，37℃ 孵育 1 小時(shí)。隨后進(jìn)行步驟 2。

(3) 血液標(biāo)本

收集約 20 ml 新鮮血液，加入裝有 3.5 ml 酸性檸檬酸葡萄糖溶液 B ( ACD ) 的試管中 。這一抗凝劑優(yōu)于 EDTA，因?yàn)樗谘嘿A存過程中更能保存高分子量 DNA。這些血液在制備 DNA 前可于 0℃ 保存數(shù)天或于 -70℃ 長(zhǎng)期保存。配制 ACD 時(shí)，混合：

檸檬酸0.48g

檸檬酸鈉1.32g

葡萄糖1.47g

加水至100 ml

用作抗凝劑時(shí)，每6ml新鮮血液中加入1ml ACD。

新鮮血液（20 ml）：以 1300g離心15分鐘，棄上層血漿，用巴斯德吸管將淡黃層小心移到另一管中并再次離心。淡黃層即為密度不均一的白細(xì)胞寬帶。將經(jīng)第二次離心的淡黃層重懸于15ml抽提緩沖液中，37℃孵育1小時(shí)，隨后進(jìn)行步驟2。

凍藏血液（20 ml）：在室溫水浴中融化，移至離心管中，用等體積 PBS 稀釋；隨后于室溫以 3500 g離心15分鐘并棄去上清液，其中含有已溶解的紅細(xì)胞用15ml抽提緩沖液重懸沉淀物；37℃孵育1小時(shí)，隨后進(jìn)行步驟2。

步驟2：蛋白酶K至終濃度為100ug/ml，用玻棒溫和地將酶混入黏稠的溶液中。

步驟3：裂解細(xì)胞的懸液置于50℃ 水浴中3小時(shí)，不時(shí)懸動(dòng)該黏稠溶液。

步驟4：溶液冷卻至室溫，如有必要就將溶液倒入離心管。加等體積經(jīng) 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）平衡的酚，緩慢地來(lái)回顛倒離心管 10 分鐘以輕輕地混合兩相 。如此時(shí)兩相未能混合形成乳濁液，則將離心管置于旋轉(zhuǎn)器上 1 小時(shí)，于室溫以 5000 g 離心 15 分鐘，使兩相分開。

步驟5：大口徑移液管（出口直徑為 0.3 cm ) 將黏稠的水相移至一潔凈的離心管中并用酚重復(fù)抽提 2 次。

步驟6：分離高分子量DNA(約200kb)：第三次酚抽提后用全部水相于4℃對(duì)4L 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)、10 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液透析4次，直至透析液的 OD270 值小于0.05。讓透析袋留有使樣品體積增至1.5~2.0倍體積的空間。下轉(zhuǎn)步驟7。

分離大小為 100~150kb的 DNA：第三次酚抽提后，將全部水相移至另一離心管中并加0.2倍體積的 10mol/L 乙酸銨。在室溫下加 2 倍體積乙醇并轉(zhuǎn)動(dòng)離心管使溶液充分混合。DNA立即形成沉淀，通常可用制成 U 形并經(jīng)封口的巴斯德吸管將沉淀從乙醇溶液中移出。而大部分污染的寡聚核糖核苷酸仍留在乙醇溶液中。如果DNA沉淀成為碎片，則在吊桶式轉(zhuǎn)頭中于室溫以 5000 g 離心 5 分鐘收集 DNA。用 70% 乙醇洗滌DNA沉淀2次，并按上述條件離心收集 DNA。盡可能*地除去70%乙醇，于室溫將DNA沉淀置于一個(gè)敞幵的管內(nèi)，直至可見的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。不要使DNA沉淀*干燥，否則極難溶解。

大約按每 5x106 細(xì)胞加 1ml TE (pH 8.0 )。將管子放在搖床平臺(tái)上慢慢搖動(dòng)直至 DNA *溶解。這通常需要12~24小時(shí)。

步驟7：測(cè)定 DNA 樣品在 260 nm 和 280 nm 處的光吸收。A260 與 A280 之比應(yīng)大于 1.75。低于此值則表明制備物中留有大量蛋白質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)加入 SDS 至終濃度為 0.5%，并重復(fù)步驟 2~7。

步驟8： 計(jì)算 DNA 濃度，進(jìn)行脈沖電場(chǎng)凝膠電泳或通過鋪在1%瓊脂糖支持層上的0.3%瓊脂糖凝膠電泳分析小量樣品。大于100kb的DNA，其遷移率應(yīng)該比完整的噬菌體 DNA 的線性二聚體分子慢。將 DNA 貯存在4℃。