質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(離心柱型)的應(yīng)用！

一、背景

質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(離心柱型)不僅適用于常用的EndA-菌株DH5α、JM109和XL-1 blue等，也適用于EndA+菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等，能有效避免EndA+菌株中高豐度核酸酶的污染，并適用于從糖類修飾水平高的野生菌株中提取質(zhì)粒。

質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(離心柱型)采用改進SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二、產(chǎn)品特點

1、離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好。

2、快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實驗。

三、使用說明

1、取過夜菌1.5毫升，5000g離心1分鐘收集細(xì)菌沉淀，棄上清。再重復(fù)一次，每管共收集3毫升過夜菌沉淀。

2、每管加入250微升溶液I，重懸細(xì)菌沉淀。確保沉淀散開，無可見細(xì)菌團塊。

3、每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細(xì)菌裂解，溶液透明。

4、每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。

5、速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。

6、將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。速離心30-60秒，倒棄收集管內(nèi)液體。

7、在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入500微升溶液PB，速離心30-60秒，洗去核酸酶污染等雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。

8、在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750微升溶液IV，速離心30-60秒，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。

9、再速離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇揮發(fā)。

10、將質(zhì)粒純化柱置于潔凈1.5毫升離心管上，加入50微升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。

11、速離心1分鐘，所得液體即為高純度質(zhì)粒。

四、應(yīng)用

用于乳酸菌質(zhì)粒提取方法及電轉(zhuǎn)化條件的研究：

從發(fā)酵食品中乳酸菌的分離出發(fā),進而從中提取高純度的質(zhì)粒,選擇合適的質(zhì)粒進行序列測定與分析,并對乳酸菌質(zhì)粒與宿主的匹配能力進行研究。

從泡菜和酸奶中共分離得到8株乳酸菌菌株,其革蘭氏染色均為陽性,無芽孢,接觸酶檢驗為陰性,兼性厭氧,能夠在5%的CO2條件下生長,代謝產(chǎn)物中有乳酸,能夠?qū)寮追幼献兂牲S色,不產(chǎn)氣,并能夠耐鹽生長。經(jīng)16S rDNA鑒定,其中6株為植物乳桿菌,2株為嗜熱鏈球菌。

對乳酸菌天然質(zhì)粒的提取方法進行研究,發(fā)現(xiàn)與方法一（O’Sullivan等建立的方法）、方法二（乳酸菌的收集和裂解按O’Sullivan等建立的方法進行,質(zhì)粒的抽提和回收按照大腸桿菌質(zhì)粒提取方法進行）相比,采用方法三（菌體裂解前用溶菌酶處理,再使用北京TIANGEN質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒的提?。┑玫降馁|(zhì)粒條帶更為清晰、明亮,提取效果更好。對方法三作進一步優(yōu)化,確定提取過程中溶菌酶的濃度為20mg/mL,處理時間為30min,同時避免了毒性物質(zhì)溴化乙錠的使用。

分別從5株乳酸菌中進行了質(zhì)粒的提取,并選擇實驗室從泡菜中分離的植物乳桿菌S1中提取的2 kb左右的質(zhì)粒pLPS1作為研究對象,對pLPS1進行了測序,用生物信息學(xué)方法對其序列進行了分析研究。該質(zhì)?；蛉L2117bp,G+C含量為38.03%。從2671448bp為開放閱讀框ORF1,共編碼393個氨基酸。編碼蛋白質(zhì)的理論分子量為44.3kDa。對編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,其中α-螺旋結(jié)構(gòu)占總蛋白量的44.27%,延展鏈占7.38%,β-轉(zhuǎn)角占4.58%,不規(guī)則卷曲占43.77%。蛋白序列的N端存在一個20個氨基酸左右的疏水區(qū),經(jīng)分析表明其具有信號肽功能。對質(zhì)粒pMG36e的電轉(zhuǎn)化條件進行了研究。

以植物乳桿菌CGMCC1.555為宿主菌,其轉(zhuǎn)化條件為:工作電壓2.25kV,甘氨酸濃度2.95%,培養(yǎng)時間3.96h,在此條件下,電轉(zhuǎn)化效率達到預(yù)測值1909cfu/μg DNA;以乳酸乳球菌乳亞種CICC 6060為宿主菌時,電轉(zhuǎn)化的條件為:工作電壓2.38kV,甘氨酸濃度2.68%,培養(yǎng)時間6.19h,在此條件下,電轉(zhuǎn)化效率達到預(yù)測值1375cfu/μg DNA。

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