（1）標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：

10X緩沖液：10 μL

4種dNTP混合物：各200umol/L

引物：各10～100pmol

模板DNA：0.1～2μg

Taq DNA聚合酶：2.5U

Mg2+ ：1.5mmol/L

（2）PCR反應(yīng)過(guò)程：

（3）PCR反應(yīng)特點(diǎn)：

靈敏度高

皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平

能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞

病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU

細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌

簡(jiǎn)便、快速

一次性加好反應(yīng)液，2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析

對(duì)標(biāo)本的純度要求低

血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA

PCR反應(yīng)體系

以DNA為模板的反應(yīng)

反應(yīng)體積：50~100μl

緩沖液

引物

底物：4種dNTP

模板：102~105拷貝

TaqDNA聚合酶

礦物油

以mRNA為模板的反應(yīng)（逆轉(zhuǎn)錄PCR）

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

體積：20 μl

緩沖液

底物：4種dNTP

引物：oligo(dT)12~18

模板：RNA

逆轉(zhuǎn)錄酶

其他試劑：RNA酶抑制劑，

MgCl2.DTT.牛血清白蛋白

PCR反應(yīng)體系同以DNA模板的反應(yīng)體系

（一）PCR反應(yīng)成分

1、模板

  單、雙鏈DNA均可。

  不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。

  一般100ng DNA模板/100mL。

  模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。

2、引物濃度

    0.1-0.5 mmol/L

    濃度過(guò)低影響產(chǎn)量，偏高引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物增加，且可增加引物二聚體的產(chǎn)生幾率。

3、Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)

    0.5-2.5 U/50 ml

    酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。

4、dNTP  20~200μmol/L

      dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度

      四種dNTP濃度應(yīng)相等

     濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量，但特異性增加

     dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。

5、 Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。

0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。

Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。

Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。

6、 PCR反應(yīng)的緩沖液

10~50mmol/L Tris-Cl 緩沖液，72℃ 時(shí)pH 7.2,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。緩沖液含50 mmol/L的KCl可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入適量二甲基亞砜或甲酰胺有利于破壞模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

（二）循環(huán)參數(shù)

1、變性  

    94oC~95oC，30-60 s

   且最初在加Taq酶之前先于97oC充分變性5~10min

2、退火  

    50oC~55oC，60-90 s

    增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;

    降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。

3、延伸

      70oC~74oC，60-120 s

      延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定

4、循環(huán)次數(shù)

     主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次

    次數(shù)過(guò)多：非特異擴(kuò)增增加

（三）PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律

在PCR反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶的催化動(dòng)力學(xué)原理。反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA產(chǎn)物逐漸積累，擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，又稱“平臺(tái)期”。到達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。到達(dá)平臺(tái)期前，TaqDNA聚合酶一般要進(jìn)行25次以上PCR循環(huán)。

多數(shù)情況下，平臺(tái)期在PCR反應(yīng)中不可避免。

PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖