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F.SIGHT2.0提高M(jìn)SC間充質(zhì)干細(xì)胞的單克隆率

來(lái)源:廣州市艾貝泰生物科技有限公司   2023年03月09日 10:28  

早在1976年,德國(guó)科學(xué)家Frieden Stein和他的同事在骨髓中發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),后來(lái)的研究者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,在特定的誘導(dǎo)條件下,能夠分化成不同類型的細(xì)胞,包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等,而且沒(méi)有醫(yī)學(xué)倫理的困擾,所以受到科學(xué)家的青睞,被廣泛應(yīng)用于組織再生、器官修復(fù)、血液病、癌癥治療等領(lǐng)域。

MSC的體外培養(yǎng)擴(kuò)增不可避免地經(jīng)歷復(fù)制性衰老,伴隨著基因組不穩(wěn)定性,這是MSC細(xì)胞治療行業(yè)一個(gè)嚴(yán)重的障礙。此外,因?yàn)榻臃N起始MSC細(xì)胞濃度不一樣,即使經(jīng)過(guò)相同的擴(kuò)增代數(shù),細(xì)胞的復(fù)制周期是不一致的,導(dǎo)致批次間生產(chǎn)的MSC細(xì)胞的穩(wěn)定性差,這也是目前MSC細(xì)胞在治療行業(yè)的一個(gè)瓶頸。 因此通過(guò)單一MSC細(xì)胞來(lái)源的穩(wěn)定細(xì)胞株為提供可持續(xù)的、穩(wěn)定的MSC細(xì)胞生產(chǎn)成為關(guān)鍵,可以助力MSC干細(xì)胞治療行業(yè)的快速發(fā)展。

為什么要挑選MSC細(xì)胞的單克隆細(xì)胞株?

細(xì)胞單克隆性,一般指用于建立最初的種子庫(kù)細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞來(lái)源。藥物生產(chǎn)過(guò)程中,具有單克隆源性的細(xì)胞庫(kù)能夠更好地保持產(chǎn)品批次之間的質(zhì)量一致性,因此在三級(jí)細(xì)胞庫(kù)建立過(guò)程中細(xì)胞的來(lái)源一致性尤為重要;這一點(diǎn)也是預(yù)防種子庫(kù)細(xì)胞變異的風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵,也可更好的對(duì)上游工藝開(kāi)發(fā)和下游產(chǎn)品質(zhì)量的把控。

相反的,多克隆細(xì)胞系構(gòu)建成功后不同細(xì)胞克隆生長(zhǎng)速度不一致,目的基因表達(dá)量比較低的細(xì)胞克隆增殖速度一般更快,因此在最初的10代左右會(huì)觀察到表達(dá)量逐漸下降,且不能長(zhǎng)期維持細(xì)胞表型。

考慮到產(chǎn)品安全性,FDA的政策和法規(guī)都要求生物制藥企業(yè)提供清晰圖片證據(jù),用以證明生產(chǎn)用的細(xì)胞株的單克隆源性。

本文詳細(xì)介紹了利用Cytena公司開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞打印技術(shù)(SCP technology),通過(guò)將單個(gè)的MSC細(xì)胞自動(dòng)分離到標(biāo)準(zhǔn)的96/384孔板中,大大加速M(fèi)SC單克隆細(xì)胞株的開(kāi)發(fā)。


材料與方法

1、細(xì)胞類型:貼壁的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)。

2、樣品處理方法:

1)   用胰酶消化處理MSC細(xì)胞,變成懸浮細(xì)胞;

2)   用biosharp DMEM低糖培養(yǎng)基清洗重懸細(xì)胞,用40 μm的篩網(wǎng)過(guò)濾樣品,去除細(xì)胞團(tuán)塊;

3)   按照7E5cells/ml的密度,將細(xì)胞加入一次性的分選芯片中。

3、分選工具:德國(guó)Cytena單細(xì)胞打印機(jī)F.SIGHT 2.0和一次性Catridge

1:克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)分選流程圖single-cell printer™,scp™

結(jié)果

表1是通過(guò)SCPTM和手動(dòng)-LD方法分選的多塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,我們可以發(fā)現(xiàn)SCPTM分選的D0單細(xì)胞率是手動(dòng)-LD的4倍,在培養(yǎng)15天后統(tǒng)計(jì)“單克隆率”發(fā)現(xiàn)是手動(dòng)-LD的3.67倍之多(表2)!

1MSC細(xì)胞單細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)表

由于MSC細(xì)胞是貼壁細(xì)胞,細(xì)胞的結(jié)團(tuán)率比較高,所以MSC的單細(xì)胞率不像懸浮類細(xì)胞的高(CHO單細(xì)胞率可以達(dá)95%以上),但是相比于平行的有限稀釋法來(lái)說(shuō),單細(xì)胞率也提高了近4倍,提高了單克隆的篩選效率。

2MSC細(xì)胞單克隆率統(tǒng)計(jì)表

采用一次性的微流控芯片進(jìn)行單細(xì)胞分選,每次只產(chǎn)生約150pL的液滴,單細(xì)胞率高。無(wú)菌的一次性的芯片可以避免項(xiàng)目之間的交叉污染,設(shè)備無(wú)需清洗和驗(yàn)證,有利于日后項(xiàng)目的申報(bào)審批。

2:微流控Cartridge芯片(150pL/單液滴體積)

討論

單細(xì)胞率是決定單克隆率高低的關(guān)鍵性因素,因此為尋求最適MSC貼壁樣品篩選條件,我們做了以下測(cè)試:

  • 板A1-3篩選圓度范圍為0.5-1,板A4縮小圓度范圍為0.7-1,直徑范圍均為15-25μm。

  • 表1中“手工-LD”部分結(jié)果包括多克隆團(tuán),因此表2中 LD方法“D15單克隆率 < 20%”。

Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)(single-cell printer™,scp™)采用設(shè)計(jì)的芯片,能溫和、高效、快速的分選,既保證了D0高的單細(xì)胞率,又結(jié)合了高分辨率的光學(xué)系統(tǒng),留下單細(xì)胞分選的“印跡”,通過(guò)設(shè)置細(xì)胞的直徑、細(xì)胞圓度、細(xì)胞熒光強(qiáng)度等質(zhì)控方式,分選出“強(qiáng)壯”的細(xì)胞,利于后期克隆恢復(fù),獲得高的單克隆率。

結(jié)論

SCPTM所獲得貼壁的MSC單克隆率是手工-LD的3.67倍多!分選條件設(shè)置為:圓度范圍在0.5-1,直徑范圍在15-25μm,更適合于MSC樣品的單細(xì)胞篩選!這也說(shuō)明了SCPTM可以很好的應(yīng)用于MSC單克隆細(xì)胞株的篩選,助力于MSC細(xì)胞在細(xì)胞治療、基因治療、組織工程以及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展!


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