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食品微生物實(shí)驗(yàn)室工作人員,必須有嚴(yán)格的無菌觀念,許多試驗(yàn)要求在無菌條件下進(jìn)行,那么,對食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室操作要求有哪些?
一、無菌操作要求
1.接種細(xì)菌時必須穿工作服、戴工作帽。
2.進(jìn)行接種食品樣品時,必須穿專用的工作服、帽及拖鞋,應(yīng)放在無菌室緩沖間,工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。
3.接種食品樣品時,應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手,然后用75%酒精棉球?qū)⑹植粮蓛?/span>。
4.進(jìn)行接種所用的吸管,平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌,打開包裝未使用完的器皿,不能放置后再使用,金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點(diǎn)燃燒灼三次后使用。
5.從包裝中取出吸管時,吸管尖部不能觸及外露部位,使用吸管接種于試管或平皿時,吸管尖不得觸及試管或平皿邊。
6.接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作,接種細(xì)菌或樣品時,吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。
7.接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲,必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處,接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min,再經(jīng)火焰燒灼。
8.吸管吸取菌液或樣品時,應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取,不得直接用口吸。
二、無菌間使用要求
1.無菌間通向外面的窗戶應(yīng)為雙層玻璃,并要密封,不得隨意打開并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及推拉門,另設(shè)有0.5~0.7m2的小窗,以備進(jìn)入無菌間后傳遞物品。
2.無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔,工作后用2%~3%煤酚皂溶液消毒,擦拭工作臺面,不得存放與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品。
3.無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊,打開紫外燈,如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時,需30W紫外燈,距離在1.0m處,照射時間不少于30min,使用紫外燈,應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作,以免引起損傷,燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭,除去上面灰塵和油垢,以減少紫外線穿透的影響。
4.處理和接種食品標(biāo)本時,進(jìn)入無菌間操作,不得隨意出入,如需要傳遞物品,可通過小窗傳遞。
5.在無菌間內(nèi)如需要安裝空調(diào)時,則應(yīng)有過濾裝置。
三、消毒滅菌要求
微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等,必須經(jīng)滅菌后方能使用。干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法。
1.滅菌前準(zhǔn)備
(1)所有需要滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴(yán)密,如用金屬筒應(yīng)將上面通氣孔打開。
(2)裝培養(yǎng)基的三角瓶塞,用紙包好,試管蓋好蓋,注射器須將管芯抽出,用紗布包好。
2.裝放
(1)干熱滅菌器:裝放物品不可過擠且不能接觸箱的四壁。
(2)大型高壓蒸氣鍋:放置滅菌物品分別包扎好,直接放入消毒筒內(nèi),物品之間不能過擠。
3.設(shè)備檢查
(1)檢查門的開關(guān)是否靈活,橡皮圈有無損壞,是否平整。
(2)檢查壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位,關(guān)好門和蓋,通蒸氣或加熱后,觀察是否漏氣,壓力表與溫度計(jì)所標(biāo)示的狀況是否吻合,管道有無堵塞。
(3)對有自動電子程序控制裝置的滅菌器,使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序,是否符合于進(jìn)行滅菌處理的要求。
4.滅菌處理
(1)干熱滅菌法:
此法適應(yīng)于在干熱情況下,不損壞、不變質(zhì)、不蒸發(fā)的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。
①器械器皿應(yīng)清洗后再干烤,以防附著在表面的污物炭化。
②滅菌時安放物品不能過擠,不要直接接觸底和箱壁,物品之間留有空隙。
③滅菌時將箱門關(guān)緊,接上電源,先將排氣孔打開約30min,排除滅菌器中的冷空氣,溫度升至160℃調(diào)節(jié)指示燈,維持1.5~2h。
④滅菌完畢后或溫度升溫過程中,須在60℃以下才能打開箱門。
(2)手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進(jìn)行:
①手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入3L清水,立式高壓鍋加水16L(重復(fù)使用時應(yīng)將水量補(bǔ)足,水變混濁需更換);
②手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中(無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用);
③蓋好頂蓋擰緊,勿使漏氣;置滅菌器于火源上加熱,立式壓力鍋通上電源,并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣(水沸騰后排氣10~15min);
④關(guān)閉排氣閥,使蒸氣壓上升到規(guī)定要求,并維持規(guī)定時間(按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)情況而定);
⑤達(dá)到規(guī)定時間后,對需干燥的物品,立即打開排氣閥排出蒸氣,待壓力恢復(fù)到零時,自然冷卻至60℃后開蓋取物,如為液體物品,不要打開排氣閥,而應(yīng)立即將鍋去除熱源,待自然冷卻,壓力恢復(fù)至零,溫度降到60℃以下,再開蓋取物,以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。
(3)臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進(jìn)行:
①關(guān)緊鍋門,打開進(jìn)氣閥,將蒸氣引入夾層進(jìn)行預(yù)熱,夾層內(nèi)冷空氣經(jīng)阻氣器自動排出;
②夾層達(dá)到預(yù)定溫度后,打開鍋室進(jìn)氣閥,將蒸氣引入鍋室,鍋室內(nèi)冷空氣經(jīng)鍋室阻氣器自動排出;
③待鍋室達(dá)到規(guī)定的壓力與溫度時,調(diào)節(jié)進(jìn)氣閥,使保持恒定;
④自然或人工降溫至60℃再開門取物,不得使用快速排出蒸氣法,以防突然降壓,液體劇烈沸騰或容器爆破;
⑤使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器,在放好物品關(guān)緊門后,應(yīng)根據(jù)物品類別按動相應(yīng)開關(guān),以便按要求程序自動進(jìn)行滅菌,滅菌時必須利用附設(shè)儀表記錄溫度與時間以備查,操作要求應(yīng)嚴(yán)格按照廠家說明書進(jìn)行;
5.滅菌溫度與時間
(1) 干熱滅菌器滅菌溫度160℃,1.5~2h。
(2) 壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間
四、間歇滅菌方法
1.滅菌方法:
利用不加壓力的蒸氣滅菌,某些物質(zhì)經(jīng)高壓蒸氣滅菌容易破壞,可用此法滅菌。
(1)將欲滅菌物品置于鍋內(nèi),蓋上頂蓋,打開排水口,使器內(nèi)余水排盡。
(2)關(guān)閉排水口,打開進(jìn)氣門,根據(jù)需要消毒10~20min。
(3)滅菌完畢關(guān)閉進(jìn)氣門,取出物品待冷至室溫溫度,放入37℃溫箱過夜,次日仍按上述方法消毒,如此三次,即可達(dá)到滅菌目的。
2.血清凝固器使用方法:
培養(yǎng)基中含有血清或雞蛋特殊成份時,因高熱會破壞其營養(yǎng)成份,故用低溫,可使血清凝固,又可達(dá)到滅菌目的:
(1)在使用該法滅菌的血清等分裝時,需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,試管、平皿也經(jīng)滅菌后使用;
(2)將培養(yǎng)基按要求使成斜面或高層,加足水后,接上電源,升溫75~90℃一小時后滅菌,放37℃溫箱過夜,再如此滅菌三次。
3.煮沸消毒:
可用煮鍋或煮沸消毒器,水沸騰后再煮5~15 min,也可在水中加入2%石炭酸煮沸5min,加入0.02%甲醛,80℃煮60min均可達(dá)到滅菌目的,但選用煮沸消毒的增消劑時,應(yīng)注意對物品的腐蝕性。
4.滅菌處理:
滅菌后物品,按正常情況已屬無菌,從滅菌器中取出應(yīng)仔細(xì)檢查放置,以免再度污染;
(1)物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉,不可作為無菌物品使用;
(2)取出的物品,如為包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用;
(3)培養(yǎng)基或試劑等,應(yīng)檢查是否符合達(dá)到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達(dá)到者應(yīng)廢棄;
(4)啟閉式容器,在取出時應(yīng)將篩孔關(guān)閉;
(5)取出的物品掉落在地或誤放不潔處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用;
(6)取出的合格滅菌物品,應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴(yán)禁與未滅菌物品混放;
(7)凡屬合格物品,應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限;
(8)每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。
五、有毒有菌污物處理要求
微生物實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理,一律不得帶出實(shí)驗(yàn)室。
1.經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi),并集中存放在**地點(diǎn),待統(tǒng)一進(jìn)行高壓滅菌。
2.經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物,必須經(jīng)121℃,30min高壓滅菌。
3.染菌后的吸管,使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中,最少浸泡24h(消毒液體不得低于浸泡的高度)再經(jīng)121℃,30min高壓滅菌。
4.涂片染色沖洗片的液體,一般可直接沖入下水道,烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中,經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道,染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后,煮沸洗滌。做凝集試驗(yàn)用的玻片或平皿,必須高壓滅菌后洗滌。
5.打碎的培養(yǎng)物,立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位,浸泡半小時后再擦拭干凈。
污染的工作服或進(jìn)行烈性試驗(yàn)所穿的工作服、帽、口罩等,應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi),經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。
六、培養(yǎng)基制備要求
培養(yǎng)基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長,因?yàn)椋鞣N微生物對其營養(yǎng)要求不**相同,培養(yǎng)目的的不同,各種培養(yǎng)基制備要求如下:
1.根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取,然后溶于蒸餾水中,在使用前對應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。
2.pH測定及調(diào)節(jié):pH測定要在培養(yǎng)基冷至室溫時進(jìn)行,因在熱或冷的情況下,其pH有一定差異,當(dāng)測定好時,按計(jì)算量加入堿或酸混勻后,應(yīng)再測試一次。培養(yǎng)基pH值一定要準(zhǔn)確,否則會影響微生物的生長或影響結(jié)果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的pH降低或升高,故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多,以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量,指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調(diào)完pH后再加入。
3.培養(yǎng)基需保持澄清,便于觀察細(xì)菌的生長情況,培養(yǎng)基加熱煮沸后,可用脫脂棉花或絨布過濾,以除去沉淀物,必要時可用雞蛋白澄清處理,所用瓊脂條要預(yù)先洗凈晾干后使用,避免因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。
4.盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器,使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。
5.培養(yǎng)基的滅菌既要達(dá)到滅菌目的,又要注意不因加熱而降低其營養(yǎng)價值,一般121℃,15min即可,如為含有不耐高熱物質(zhì)的培養(yǎng)基如糖類、血清、明膠等,則應(yīng)采用低溫滅菌或間歇法滅菌,一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等,待基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入;
6.每批培養(yǎng)基制備好后,應(yīng)做無菌生長試驗(yàn)及所檢菌株生長試驗(yàn)。如果是生化培養(yǎng)基,使用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng),觀察生化反應(yīng)結(jié)果,應(yīng)呈正常反應(yīng),培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久,必要時可置4℃冰箱存放。
7.目前,各種干燥培養(yǎng)基較多,每批需用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行生長試驗(yàn)或生化反應(yīng)觀察,各種培養(yǎng)基用相應(yīng)菌株生長試驗(yàn)良好后方可應(yīng)用,新購進(jìn)的或存放過久的干燥培養(yǎng)基,在配制時也應(yīng)測pH,使用時需根據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進(jìn)行。
8.每批制備的培養(yǎng)基所用化學(xué)試劑、滅菌情況及菌株生長試驗(yàn)結(jié)果、制作人員等應(yīng)做好記錄,以備查詢。
七、樣品采集及處理要求
1.所采集的檢驗(yàn)樣品一定要具有代表性,采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運(yùn)輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查,檢查是否有污染源存在。
2.根據(jù)食品的種類及數(shù)量,采樣數(shù)量及方法應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的要求進(jìn)行。
3.采樣應(yīng)注意無菌操作,容器必須滅菌,避免環(huán)境中微生物污染,容器不得使用煤酚皂溶液,用新潔爾滅、酒精等消**物滅菌,更不能含有此類消**物或抗生素類藥物,以避免殺死樣品中的微生物,所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應(yīng)用。
4.樣品采集后應(yīng)立即送往檢驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn),送檢過程中一般不超過3h,如,路程較遠(yuǎn),可保存在1~5℃環(huán)境中,如需冷凍者,則在凍存狀態(tài)下送檢。
5.檢驗(yàn)室收到樣品后,進(jìn)行登記(樣品名稱、送檢單位、數(shù)量、日期、編號等),觀察樣品的外觀,如果發(fā)現(xiàn)有下列情況之一者,可拒絕檢驗(yàn):
(1)樣品經(jīng)過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者,失去代表原食品檢驗(yàn)意義者;
(2)瓶、袋裝食品已啟開者,熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者,即失去原食品形狀者(食物中毒樣品除外);
(3)按規(guī)定采樣數(shù)量不足者;
對送檢符合要求的樣品,檢驗(yàn)室收到后,應(yīng)立即進(jìn)行檢驗(yàn),如果條件不具備,應(yīng)置4℃冰箱存放,及時準(zhǔn)備創(chuàng)造條件,然后進(jìn)行檢驗(yàn)。
6.樣品檢驗(yàn)時,根據(jù)其不同性狀,進(jìn)行適當(dāng)處理。
(1)液體樣品接種時,應(yīng)充分混合均勻,按量吸取進(jìn)行接種。
(2)固體樣品,用滅菌刀、剪取其不同部位共25g,置于225mL滅菌生理鹽水或其他溶液中,用均質(zhì)器攪碎混勻后,按量吸取接種。
(3)瓶、袋裝食品應(yīng)用滅菌操作啟開,根據(jù)性狀選擇上述方法處理后接種。
八、 樣品檢驗(yàn)、記錄和報告的要求
1.檢驗(yàn)室收到樣品后,首*行外觀檢驗(yàn),及時按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn),檢驗(yàn)過程中要認(rèn)真、負(fù)責(zé)、嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作,避免環(huán)境中微生物污染。
2.樣品檢驗(yàn)過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗(yàn)記錄,以作為對結(jié)果分析、判定的依據(jù),記錄要求詳細(xì)、清楚、真實(shí)、客觀、不得涂改和偽造。
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