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細(xì)胞培養(yǎng)用“胰蛋白酶” or “膠原蛋白酶”?

來源:愛必信(上海)生物科技有限公司   2023年05月15日 14:43  

在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),首先要對(duì)新鮮取材的動(dòng)物組織等進(jìn)行處理,或用機(jī)械的方法,或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時(shí)間,將組織分散成單個(gè)細(xì)胞即原代培養(yǎng)。在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí),貼壁細(xì)胞需要重新用胰蛋白酶等處理,使之分散成單個(gè)的細(xì)胞。那么“胰蛋白酶”和“膠原蛋白酶”到底有什么區(qū)別呢?我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)該如何選擇?

盡管胰蛋白酶和膠原蛋白酶都是細(xì)胞培養(yǎng)中常用于將體積較小的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞的消化液,但它們的作用機(jī)制及適用情況并不相同。

 

一、胰蛋白酶的作用特點(diǎn)

 

胰蛋白酶分離自牛、豬等動(dòng)物的胰,作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鏈,除去細(xì)胞間黏蛋白及糖蛋白,從而使細(xì)胞分離,是應(yīng)用廣泛的消化物,適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,如胚胎組織、羊膜、上皮組織、肝、腎等軟組織以及傳代細(xì)胞等。胰蛋白酶的消化作用與酶的濃度、pH、溫度、組織塊的大小以及組織的硬度都有關(guān)系。胰蛋白酶濃度過大或消化時(shí)間太長,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被消化;但反之消化不充分也達(dá)不到分散細(xì)胞的目的。此外,血清明顯抑制胰蛋白酶的活性,Ca2+和Mg2+對(duì)胰蛋白酶的活性有一定抑制作用。

根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模蛇x用含/不含EDTA或酚紅的胰蛋白酶,其作用如下:

 

EDTA(乙二胺四乙酸):胰蛋白酶中的EDTA主要起到螯合金屬離子,使細(xì)胞更容易分散的作用 EDTA可以螯合Ca2+ 或Mg2+,而細(xì)胞表面很多和培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶結(jié)合的蛋白都是帶有Ca2+ 或Mg2+的,把這些離子螯合后,可以加速細(xì)胞和培養(yǎng)皿的脫離,促進(jìn)消化。EDTA是2價(jià)陽離子螯合劑,所以能螯合鈣、鎂等離子。上皮類細(xì)胞的連接存在“橋?!苯Y(jié)構(gòu),是細(xì)胞間最“牢固”的連接,但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細(xì)胞時(shí),加入EDTA,可以破壞細(xì)胞的橋粒結(jié)構(gòu),使細(xì)胞能夠分散成單個(gè)細(xì)胞。通俗地說,就是破壞細(xì)胞間的粘連。

 

酚紅:胰蛋白酶中的酚紅主要是起到PH指示劑的作用。胰蛋白酶的最佳活性在7至9的pH范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)。在此范圍內(nèi)的酚紅呈粉紅色。由于環(huán)境條件,胰蛋白酶的pH可能變?yōu)樗嵝裕食壬⑹挂鹊鞍酌傅男Ч档?。使用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4-7.6可以優(yōu)化胰蛋白酶活性。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè),一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

 

濃度:一般常用胰酶的工作濃度為0.25%,而半貼壁細(xì)胞或?qū)σ让该舾械募?xì)胞常采用低濃度(0.05%)的胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化。

產(chǎn)品信息:

貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

  規(guī)格

貨期

abs47047375

胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%),不含酚紅

100mL

現(xiàn)貨

abs47014938

胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%),含酚紅

100mL

現(xiàn)貨

abs47048223

胰蛋白酶消化液(0.25%),不含酚紅

100mL

現(xiàn)貨

abs47014937

胰蛋白酶消化液(0.25%),含酚紅

100mL

現(xiàn)貨

 


貼壁細(xì)胞消化實(shí)驗(yàn)方案:

(1)吸去培養(yǎng)液,用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次,以去除殘余的血清。

(2)加入少量胰蛋白酶消化液,蓋過細(xì)胞即可,室溫放置1-2分鐘。不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同,對(duì)于貼壁牢固的細(xì)胞可適當(dāng)延長消化時(shí)間。

(3)顯微鏡下觀察,細(xì)胞明顯收縮,并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化;或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來。此時(shí)吸除消化液。加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打下細(xì)胞,即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(4)如果發(fā)現(xiàn)消化不足,可加入胰蛋白酶消化液重新消化。

(5)如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過長,未及時(shí)吹打細(xì)胞,細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落,直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘,沉淀細(xì)胞,盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后,加入含血清的培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

 

組織的消化:不同的組織需要消化的時(shí)間相差很大,通常以消化后可以充分打散組織為宜。

 

二、膠原蛋白酶的作用特點(diǎn)

 

膠原蛋白酶是能在一定的pH和溫度下切割膠原蛋白主體螺旋多肽鏈的酶類,主要用于水解結(jié)締組織中的膠原蛋白,適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。當(dāng)擬消化的組織較硬,內(nèi)含較多的結(jié)締組織或膠原成分時(shí),用胰蛋白酶解離細(xì)胞效果較差,可采用膠原酶解離細(xì)胞法。鈣、鎂離子以及血清不會(huì)影響膠原酶的消化作用,其消化作用緩和,且無需機(jī)械振蕩。

 

目前商業(yè)化的膠原酶因所含組分的差異分為五類,其在應(yīng)用上具有一定區(qū)分:

(1)膠原酶Ⅰ型:含有比較均勻的各種酶活力(包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性),通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備。

(2)膠原酶Ⅱ型:比I型膠原酶含更高的梭菌蛋白酶活性,通常用作心臟、骨、肝、甲狀腺、唾液腺和軟骨等組織的原代細(xì)胞制備。

(3)膠原酶Ⅲ型:含較低的次級(jí)蛋白酶污染物水解活性,但具典型的膠原酶活性。常用于乳腺組織的原代細(xì)胞制備。

(4)膠原酶Ⅳ型:含較低的胰酶活性以降低對(duì)膜蛋白和受體的損害,通常用于胰島細(xì)胞制備,和維持受體完整性比較重要的其他研究,也可用于髓系細(xì)胞制備。

(5)膠原酶V型:含更高的膠原酶和酪蛋白活性,更低胰酶水平以降低對(duì)膜蛋白和受體造成損傷。適用于胰島制備。

 

產(chǎn)品信息:

貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

 規(guī)格

貨期

abs47048000

膠原酶Ⅰ

100mg/1g

現(xiàn)貨

abs47048001

膠原酶Ⅱ

100mg/1g

現(xiàn)貨

abs47048002

膠原酶Ⅲ

100mg/1g

現(xiàn)貨

abs47048003

膠原酶Ⅳ

100mg/1g

現(xiàn)貨

abs47048004

膠原酶Ⅴ

100mg/1g

1-2周


溫馨提示:absin所有產(chǎn)品僅用于科學(xué)研究,請(qǐng)勿藥物、家用或其他用途。


Absin特色產(chǎn)品線:

WB相關(guān):ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠;IHC相關(guān):二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動(dòng)劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發(fā)試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體;定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

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