1.  引言

雖然 DLS 在制藥行業(yè)廣泛使用，但關于方法開發(fā)和驗證主題的文章很少。提及 DLS 的藥典測試是 USP<729>脂質(zhì)注射乳劑中的球體大小分布。1 因此，本文提供了有關在制藥行業(yè)中使用 DLS 的一些見解。

2.  USP<729>

此標準要求使用 100、250 和 400 nm 三個尺寸規(guī)格的 PSL 標準粒子來驗證 DLS 系統(tǒng)。本文作者不理解為什么選擇這些粒徑，尤其是合格/不合格的標準是 500 nm。

許多使用DLS 的專家認為，僅以一種粒徑進行測試應該即可驗證系統(tǒng)是否正常運行。對這些標準進行3次測量，強度加權(quán)平均粒徑和標準偏差應與預期值在可接受的誤差范圍內(nèi)一致。而可接受的度是根據(jù)“在可接受的誤差范圍內(nèi)”給出的。也許平均粒徑在 ±10% 的范圍內(nèi)是合理的。

系統(tǒng)適用性部分指出，如果 CV 不超過 10%，則分析標準品時的重現(xiàn)性符合標準。通過 USP<729>測試要求強度平均粒徑小于 500 nm (0.5 µm) 并且卡方值 (x2) 保持“可接受的低”。Nicomp® 用戶手冊指出，良好的高斯結(jié)果的卡方值低于2 - 3。因此卡方值<3 表示通過結(jié)果。

3.  質(zhì)量標準說明

因為USP<729>測試是使用 DLS 的藥典專著，其質(zhì)量標準設定值得考慮，但藥典質(zhì)量標準不一定適合所有藥物。一種更常見的規(guī)范方法是定義強度平均值的值和范圍以及與分布寬度相關的一些計算。DLS 的 ISO 標準建議關注強度平均值和多分散性指數(shù)(PI)。²

作者看到的一些 DLS 規(guī)格包括 D10、D50 和 D90 的值。這些值可能來自制藥行業(yè)廣泛使用激光衍射進行粒度分析。USP<429>測試光衍射測量粒徑3經(jīng)常使用 D10、D50 和 D90。設置質(zhì)量標準的另一種方法是從USP<429>中借鑒重現(xiàn)性相關內(nèi)容， USP<429>中“重復”部分給出的基于體積分布的重現(xiàn)性范圍為：

● D50 = 10%

● D10, D90 = 15%

● 在 10 µm 以下，這些最大值可以加倍

遵循這些指南的內(nèi)容，DLS 規(guī)格（根據(jù)定義尺寸小于 10 µm）對于強度平均值可以是可重復的 ±20%，對于 PI 或其他計算結(jié)果指示分布寬度是可重復的 ±30%。對于某些藥品，這可能是一個可以接受的范圍，但要注意當粒徑非常小時出現(xiàn)的統(tǒng)計問題。如果平均粒徑為 500 nm，±20%，則范圍為 400 – 600 nm，這還不錯。但對于平均粒徑為 10 nm 的蛋白質(zhì)，范圍則為 8-12 nm，這樣的粒徑跨度變得非常挑戰(zhàn)且難以接受。

4.  分析方法開發(fā)

在開發(fā)方法之前，需要調(diào)查樣品制備問題。這可以從簡單的（將樣品移入比色皿中）到復雜的（用表面活性劑和超聲波分散）。樣品制備的主題超出了本文檔的范圍，但已在之前的技術說明中討論過。4 使用 DLS 制備樣品進行分析時需要考慮的一些建議包括：

—— 測試濃度的影響。測量、稀釋并再次測量。

—— 測試測量時間的影響。測量 3、5 和 10 分鐘。

—— 確保任何稀釋劑都經(jīng)過充分過濾。WFI 可能不夠干凈。

—— 確保使用樣品池都足夠干凈。

—— 是否應使用過濾器去除樣品中的大顆粒？

—— 哪個樣品池合適。

—— 調(diào)查任何可能影響結(jié)果的儀器設置。

優(yōu)化樣品制備步驟和儀器設置后，就可進行測試重復性實驗。調(diào)查分析時間的微小變化是否對結(jié)果有任何重大影響。如果該方法需要 5 分鐘的分析時間，則在 4 分 30 秒和 5 分 30 秒時測試。檢查結(jié)果是否相同。

一旦方法得到優(yōu)化，下一步就是按照標準 FDA 指南記錄該方法。5 目標是足夠詳細地描述程序，以便其他操作員可以執(zhí)行相同的測試并生成相同的結(jié)果。列出了必須包含的基本信息：

—— 原理/范圍：分析測試/技術的基本原理。

—— 裝置/設備：儀器類型、激光、檢測器、檢測角度和樣品池類型。

—— 操作參數(shù)：溫度、粘度、分析時間和通道寬度。

—— 試劑/標準品：用于驗證性能的聚苯乙希乳膠 (PSL)。PSS 建議使用 90 nm PSL（請參閱 Entegris 技術說明 - 系統(tǒng)驗證）。

—— 標準控制溶液制備：稀釋劑，稀釋。⁶  

—— 程序：程序的逐步描述。將準備好的樣品放入比色皿中，放入到系統(tǒng)中，定義參數(shù)并進行測量。

—— 系統(tǒng)適用性：測試以確保系統(tǒng)在使用時能夠正常運行。⁶

—— 計算：所有結(jié)果計算通常直接在DLS 系統(tǒng)操作系統(tǒng)軟件中進行。⁸ 可以在電子表格中進行額外的統(tǒng)計計算。

—— 數(shù)據(jù)報告：數(shù)字數(shù)據(jù)、格式、有效數(shù)字的表示。Entegris 建議將結(jié)果重點放在光強強度加權(quán)平均直徑上。

5.  關于參考標準和材料的說明

如上所述，我們認為單個粒徑的測試足以驗證系統(tǒng)是否正常運行。多家供應商提供多種粒徑標準品，客戶可以選擇他們推薦使用的樣品。但Entegris對兩種 PSL 標準粒子擁有豐富經(jīng)驗，這些也是我們通常建議客戶用來驗證其 Nicomp6 的樣本。Thermo Fisher 3000 系列 NIST 可溯源 90 nm 標稱 PSL 標準通常用于驗證 Nicomp 性能。樣品的目錄號為 3090A，認證值為 92 ± 3 nm。另一個經(jīng)常使用的樣品是 Thermo Fisher 目錄號 5009A，值為 90 nm。該樣品不可追溯到 NIST，但我們有足夠的經(jīng)驗推薦使用該樣品，而且它比 3000 系列產(chǎn)品便宜。

注：DLS 是一種不需要校準的第一原理技術。該系統(tǒng)使用一種或多種 PSL 標準進行驗證。如果系統(tǒng)未通過驗證步驟，則無法進行調(diào)整以使結(jié)果進入預期范圍。驗證結(jié)果失敗可能是由于系統(tǒng)工作不正常而需要維修，或者更常見的是標準粒子準備不當，應在嘗試另一次測量之前重新準備。

6.  儀器介紹

參考資料

1 USP<729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)

3 USP<429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation