ELISpot（Enzyme-linked ImmunoSpot Assay）全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測，在酶聯(lián)免疫吸附技術（即ELISA）的基礎上結合了細胞培養(yǎng)技術。ELISpot捕獲的目標來自于包被板中培養(yǎng)的細胞在刺激下新鮮分泌的蛋白（抗體或者細胞因子等），去除細胞后，通過酶促反應放大效應展現出有色斑點。ELISpot是一種高度敏感的免疫檢測技術，可在單細胞水平檢測分泌細胞的頻率，從而可以對樣本中活細胞免疫狀態(tài)進行動態(tài)的監(jiān)測評估。

FluoroSpot技術是ELISpot技術的進階，通過熒光團而不是酶和底物組合對斑點進行可視化，從而改進了雙酶聯(lián)斑點的檢測。FluoroSpot技術將不同發(fā)射波長的熒光團混合在一起，只要加一張濾光片，就可以精確的濾出目標熒光，而遮蔽掉其它顏色熒光，熒光之間可以互不干擾。這對于雙因子，甚至多因子ELISpot檢測都是十分理想的手段[1]。

ELISpot/FluoroSpot技術簡要的實驗流程如圖1所示：

（1）單克隆包被抗體加入乙醇預混的PVDF膜96孔板中進行包被；

（2）接種細胞并加入相應的刺激物進行孵育；

（3）分泌的蛋白（抗體或者細胞因子等）被包被抗體捕獲；

（4）去除細胞，加入相應的檢測抗體（ELISpot為生物素標記抗體，FluoroSpot為熒光標記抗體或Tag標簽標記抗體）；

（5）加入酶偶聯(lián)鏈霉親和素（ELISpot）/加入抗標簽的熒光標記抗體（FluoroSpot）；

（6）加入底物，在酶促作用下顯色斑點（ELISpot）/在激發(fā)光的作用下檢測發(fā)射光（FluoroSpot）。

圖1：ELISpot/FluoroSpot技術簡要的實驗流程

高靈敏度

ELISpot理論上可達到百萬分之一的靈敏度，也就是說，在一百萬個細胞中只要有一個分泌細胞因子的陽性細胞就能檢測出來。實際中，由于考慮到細胞在孔的底部形成單層而不堆積，一般96孔板中最多鋪40~60萬個細胞/孔，所以實際中ELISpot也可以達到幾十萬分之一的級別。比傳統(tǒng)的ELISA方法和流式方法（細胞內細胞因子染色法ICS）高2~3個數量級，是目前為止最為靈敏的免疫檢測技術。

單細胞水平

ELISpot技術為一種單細胞水平、活細胞功能檢測。檢測的是單個細胞分泌，而非細胞群體的平均分泌，對研究生物體的細胞免疫和細胞功能提供有效的檢測策略。也就是說，ELISpot這種基于單細胞水平的檢測可以提供更多的免疫信息。

功能性檢測

ELISpot檢測是動態(tài)的免疫檢測，斑點代表分泌細胞在一段時間內的分泌動態(tài)，即“Footprint”。斑點的強弱和數量反映了細胞對刺激物的反應能力和分泌細胞因子的動態(tài)能力，這是體現細胞免疫反應最重要的功能指標。而ELISA只能檢測細胞已分泌到上清中的遺留物，只能間接的反映細胞功能；流式細胞內細胞因子染色法ICS是把本該分泌出來的細胞因子人為的固定在細胞內，從而反映細胞應對刺激產生細胞因子的能力，而不能真實的反應檢測細胞的免疫狀態(tài)和分泌細胞因子的能力。

高通量檢測

ELISpot整個流程基于96孔微孔板，適用于高通量實驗和篩選[2]。

FluoroSpot技術可以說是ELISpot技術的進階，其優(yōu)勢非常明顯，除了具有ELISpot的優(yōu)勢外，還能實現在同一孔中對單細胞分泌的多種細胞因子進行同時檢測，更節(jié)省時間、樣本，更好的保證樣本批次的一致性。更重要的是能夠分辨僅分泌單因子、分泌雙因子或三因子甚至四因子的細胞，結合多種因子的分泌更準確地對細胞的亞群進行鑒定，實現細胞群體的多功能性分析。

基于ELISpot/FluoroSpot技術的高靈敏度、高通量、單細胞水平、功能檢測等優(yōu)點，廣泛應用于免疫學研究和臨床應用，例如疫苗的研發(fā)和臨床評估，基因與細胞治療、移植評估等。

疫苗的研發(fā)和臨床評估

早在2003年發(fā)布的《預防用DNA疫苗臨床前研究技術指導原則》中指出“在評價細胞免疫效價時，應當建立檢測評價細胞免疫的方法（如特異性CTL反應的方法或Elispot方法等）”。而2020年CDE發(fā)布的《xin guan冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究》指導原則中也強調了mRNA疫苗的質量研究需要進行體內效力試驗，推薦使用ELISpot技術檢測評價mRNA疫苗的細胞免疫反應。

ELISPOT是一種高度敏感的檢測方法，可檢測體外抗原刺激后PBMC中單個細胞釋放的細胞因子。最常測量的細胞因子是IFN-γ ，其可由CD4+（Th1）和CD8+（細胞毒性）T細胞分泌。根據起始細胞（完整PBMC或CD4細胞耗盡的PBMC）和用于刺激的抗原（全蛋白、活的或滅活/殺死的病毒、肽），該測定可用于測量由CD4+和/或CD8+T細胞分泌的IFN-γ。并且可進一步比較CD4和CD8T細胞的特異性細胞免疫應答。在健康供體中，大多數抗原特異性T細胞的百分比通常低于1:100000 PBMC的檢測限。然而，在病毒感染期間或疫苗接種后，存在于外周的抗原特異性T細胞的百分比會顯著增加。因此，免疫或感染后特異性T細胞前體頻率的增加將表明疫苗/病原體誘導的陽性免疫應答。ELISpot技術已經成為評價疫苗細胞免疫反應有效的指標[3]。

病毒肺炎是一種由冠狀病毒引發(fā)的肺部炎癥，xin guan疫苗是預防新冠的有效方法，目前多款疫苗已上市或進入臨床試驗階段。據報道隨著新突變株的出現，出現了中和抗體逃逸的現象，但是細胞免疫非常穩(wěn)定；而且隨著時間的推移，體液免疫（中和抗體）有所下降，但是細胞免疫非常強大且穩(wěn)定。因此抗體至關重要，T細胞免疫功能的評估也是至關重要的。由中國工程院陳薇院士團隊和康希諾生物公司（CanSino Biologics）共同研發(fā)的腺病毒5型載體（Ad5）xin guan病毒疫苗在I-III期臨床以及霧化腺病毒5型載體（Ad5）xin guan病毒疫苗I期臨床實驗中采用ELISpot技術評估細胞免疫應答，進行驗證免疫原性和安全性[4]，如圖2所示。

圖2：霧化腺病毒5型載體（Ad5）xin guan病毒疫苗I期臨床ELISpot實驗

考慮到一些無癥狀病毒接觸病例與無血清轉化的細胞免疫應答相關，表明在缺少中和抗體的情況下SARS-CoV-2特異性T細胞可能與疾病控制相關[5]。BioNTech和輝瑞共同研發(fā)的mRNA疫苗（BNT162b1，BNT162b2）采用ELISpot技術進行細胞免疫藥效學評估以及疫苗誘導免疫原性分析[6, 7]，如圖3所示。

圖3：mRNA疫苗ELISpot實驗

在流感疫苗中利用免疫斑點平臺的高靈敏度，將其與熒光團標記的抗細胞因子抗體結合（FluoroSpot），在單細胞水平上同時測量IFN-γ和IL-2分泌，以評估pH1N1的異亞型記憶T細胞的功能性細胞因子特征，并進行深入的探索研究。其中發(fā)現未感染H1N1的成年人具有很高的預先存在的、循環(huán)的pH1N1特異性僅分泌IFN-γ 的CD8+效應記憶T細胞[8]，如圖4所示。

圖4：pH1N1的異亞型記憶T細胞FluoroSpot實驗

滅活流感疫苗主要通過誘導菌株特異性抗體來提供保護性免疫。由于持續(xù)的抗原漂移和偶爾的變化，迫切需要能夠誘導更廣泛保護的疫苗。歷史證據表明，在缺乏流感特異性抗體的情況下，流感特異性CD8+和CD4+T細胞在從流感感染恢復中發(fā)揮重要作用[9, 10]。減毒流感活疫苗LAIV誘導的系統(tǒng)性T細胞對漂移菌株具有交叉反應性的概念，提供了潛在的臨床保護。研究了專注于局部扁桃體組織中的早期T細胞反應，以研究LAIV是否在扁桃體中誘導交叉反應性CD8+T細胞。研究了接種LAIV后扁桃體和外周血單個核細胞（PBMC）中的菌株特異性T細胞反應以及扁桃體中交叉反應性CD4+和CD8+T細胞應答[11]，如圖5所示。

圖5：LAIV疫苗ELISpot實驗

基因與細胞治療

癌癥的發(fā)生與發(fā)展是機體細胞免疫機能減弱的結果，增強機體針對癌細胞的特異性細胞免疫反應是癌癥治療的重要措施之一。在介導腫瘤免疫治療中，T細胞具有舉足輕重的地位。ELISpot和FluoroSpot技術可以檢測腫瘤抗原特異性T細胞的誘導，并通過檢測細胞毒性T細胞釋放的顆粒酶B或穿孔素來表征細胞介導的細胞毒性機制。ELISpot和FluoroSpot技術通常可用于評估癌癥疫苗的功效，也可用于鑒定特定的腫瘤抗原。在癌癥研究中使用ELISpot不僅可以評估T細胞，也可評估B細胞用于監(jiān)測癌癥疫苗誘導的抗體反應的質量和持續(xù)時間。多發(fā)性骨髓瘤治療后的高復發(fā)率仍然是一個未解決的問題。免疫療法，尤其是CAR-T療法，由于其非交叉耐藥機制，被認為是治療這種惡性腫瘤的最有希望的策略[12]。然而，即使在CAR-T治療后，患者最終也會復發(fā)。因此，針對不同靶點的聯(lián)合治療可能是一種合理的策略。一些研究在使用自然殺傷細胞、細胞毒性T淋巴細胞和T細胞受體轉基因T（TCR-T）細胞聯(lián)合治療骨髓瘤方面取得了突破。通過人IFN-γ ELISpot 實驗鑒定出AKAP4中的CTL表位，該表位可用于開發(fā)癌癥疫苗或T細胞受體轉基因T細胞（TCR-T）以殺死骨髓瘤細胞[13]，如圖6所示。

圖6：AKAP4 人IFN-γ ELISpot 實驗

以AAV病毒為載體的基因治療，在給病人治療中，理論上沒有已知的相關病理，但在實際應用中可能會導致意外的免疫反應，這可能會降低治療效率，并可能會帶來安全風險。通過ELISPOT的技術評估病毒載體在人體是否能引起T細胞免疫反應是臨床階段評估基因治療安全性重要的指標參數?；谥委煹陌l(fā)展階段，生物分布、脫落和免疫原性已成為非臨床和臨床開發(fā)基因療法安全性評估的重要組成部分[14]。

移植

ELISpot檢測可以提供移植前后受者免疫反應的有價值信息，在預測同種異體移植排斥反應風險和發(fā)生率及存活率方面具有重要的臨床意義。受者和器官供體之間人類白細胞抗原（HLA）和其他多態(tài)性抗原系統(tǒng)的差異導致移植后發(fā)生同種異體排斥反應。預測受者對移植器官的免疫反應可使用個體化免疫抑制方案減少排斥反應的發(fā)生率。酶聯(lián)免疫吸附斑點（ELISpot）測定法因其通過評估T淋巴細胞反應性預測排斥反應的能力而受到廣泛研究。Hricik et al. (2003)第一個注意到陽性IFN-γ ELISpots與HLA錯配數量之間正相關的趨勢。Tung TH et. al., （2005）用ELISPOT監(jiān)視患者體內的免疫排斥反應，可以有針對性的用藥，避免盲目的使用免疫抑制劑。Slavcev et al.（2015）觀察到IFN-γ分泌細胞的頻率與HLA錯配的數量之間存在明顯的關系。Luque（2018）記錄了一種B細胞FluoroSpot分析，該分析能夠列舉來源于循環(huán)供體反應性記憶B細胞的多種HLA特異性抗體分泌細胞。有助于指導新的治療方法，并提供移植前后受者免疫反應的臨床相關數據[15]。

隨著ELISpot/FluoroSpot技術的成熟，以及越來越多的標準化試劑、材料、儀器的加入，使得此技術方法在實驗室間的應用得到穩(wěn)定性和標準化的保障。相關的行業(yè)內指導也有助于增強檢測方法的科學性、標準化和規(guī)范化，使得ELISpot/FluoroSpot技術運用到更多的生物醫(yī)藥生物分析中。

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