干貨分享 | SNP研究中，你一定遇到過(guò)這些問(wèn)題，附解答！
SNP作為第三代分子標(biāo)記，其應(yīng)用非常廣泛，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中，可以進(jìn)行性狀基因的精細(xì)定位、分子輔助育種、種子資源鑒定等；在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，可用于疾病的分子遺傳機(jī)制研究、疾病基因定位、藥物敏感或疾病易感性位點(diǎn)篩選等，生命科學(xué)研究的方方面面，都與之相關(guān)。
SNP的研究主要分為SNP的發(fā)現(xiàn)及SNP的基因分型。SNP的發(fā)現(xiàn)是應(yīng)用的基礎(chǔ)，而SNP的基因分型是應(yīng)用的技術(shù)手段。新SNP通常是基于測(cè)序技術(shù)，利用已有數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行重測(cè)序發(fā)現(xiàn)的，但需要進(jìn)行其他方法的驗(yàn)證；而已知SNP的基因分型可以通過(guò)芯片技術(shù)來(lái)篩選與表型相關(guān)的SNP，從中優(yōu)選出多態(tài)性高，均勻分布的少量SNP，這些少量的SNP可以在大量樣本中進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)樣本情況、SNP數(shù)量、試驗(yàn)設(shè)計(jì)等選擇合適的方法學(xué)。前段時(shí)間，小編和大家一起了解了SNP分型檢測(cè)的幾種常用方法、原理以及在不同領(lǐng)域的應(yīng)用情況等，近期小編也收集到部分小伙伴關(guān)于SNP的問(wèn)題，整理如下，方便大家進(jìn)一步對(duì)一些細(xì)節(jié)性問(wèn)題進(jìn)行了解哦。
想了解SNP就得先了解什么是DNA的多態(tài)性。人與人之間絕大部分的DNA序列是一樣的，DNA的多態(tài)性是指正常人群中，DNA分子或基因的某些位點(diǎn)可以發(fā)生改變，使DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)各不相同，但并不影響基因的表達(dá)，形成多態(tài)；DNA的多態(tài)性可以看作是在分子水平上的個(gè)體區(qū)別的遺傳標(biāo)志。DNA多態(tài)性主要表現(xiàn)為反應(yīng)限制性酶切位點(diǎn)變化的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、反應(yīng)重復(fù)單位拷貝數(shù)差異的串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性，以及反應(yīng)點(diǎn)突變的單核苷酸多態(tài)性（SNP）等。
為什么說(shuō)SNP是二等位基因系統(tǒng)，而不像RFLP和SSR是多等位基因系統(tǒng)？單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，即在群體中，基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的核苷酸，并且其出現(xiàn)的頻率大于1%。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（transition嘧啶和嘧啶之間或者嘌呤和嘌呤之間的交換）或顛換（transversion嘧啶和嘌呤之間的交換）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。SNP 在CG 序列上出現(xiàn)較為頻繁，由于CG 中C 即胞嘧啶常被甲基化，自發(fā)脫氨后即變?yōu)樾叵汆奏，因此大多數(shù)情況下，都是發(fā)生的C→T的轉(zhuǎn)換，而變成A和G的概率很小，所以一般認(rèn)為SNP是二等位的，或者是二態(tài)性，即一個(gè)堿基只會(huì)突變?yōu)榱硪环N堿基，而不會(huì)同時(shí)突變?yōu)榱硗舛喾N堿基。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs只需要＋／－的分析，而不用分析片段的長(zhǎng)度，也讓其應(yīng)用更為廣泛。
SNP是單堿基多態(tài)性，是一個(gè)群體概念，這個(gè)差異占群體的1%以上。若germline mutation頻率<1%，則認(rèn)為是一個(gè)點(diǎn)突變。SNP是各種生物都有的，通過(guò)同源基因比對(duì)獲得的，一般不會(huì)發(fā)生變化，而點(diǎn)突變只對(duì)單一基因而言，所以從數(shù)量上SNP比點(diǎn)突變多得多。如果突變發(fā)生在生殖細(xì)胞，則可以遺傳，但是只要這個(gè)突變?nèi)簺](méi)有達(dá)到總?cè)后w的1%，它就只有一個(gè)突變株/系，達(dá)到了1%就是多態(tài)性了。
SNV，即單核苷酸位點(diǎn)變異（single nucleotide variants），SNP，即單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism)，這兩個(gè)概念都是指單核苷酸的改變，只不過(guò)SNP一般是二態(tài)的，而SNV沒(méi)有這樣的限制。另外，如果只是在病人體內(nèi)檢測(cè)到單個(gè)核苷酸的變異，而其在人群中出現(xiàn)的頻率未知，則可看作SNV。
分子標(biāo)記（Molecular Markers）是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)即核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。根據(jù)分子標(biāo)記檢測(cè)的原理、技術(shù)手段以及通量效率，一般將分子標(biāo)記分為三大類，分別是基于分子雜交技術(shù)的第一代分子標(biāo)記、基于PCR技術(shù)的第二代分子標(biāo)記以及基于測(cè)序技術(shù)的第三代分子標(biāo)記。不同的分子標(biāo)記技術(shù)如圖1 所示。
最典型的代表類型如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP），是以Southern雜交為核心設(shè)計(jì)。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是指同種生物不同個(gè)體間DNA 序列產(chǎn)生差異，形成可被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的序列進(jìn)而可被消化，被消化后的產(chǎn)物由于長(zhǎng)度不同可通過(guò)電泳進(jìn)行分型，RFLP操作簡(jiǎn)單、成本低廉，從而使RFLP被選為人類基因組計(jì)劃的第一代遺傳標(biāo)記，用于基因圖譜繪制、DNA指紋分析、疾病易感性分析、基因診斷、親權(quán)鑒定等。以PCR 為核心的分子標(biāo)記技術(shù)包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNAs，RAPD），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（SSR）等，也有學(xué)者僅將微衛(wèi)星作為第二代分子標(biāo)記代表，即短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR），一般由2-6個(gè)核苷酸組成，是廣泛分布在真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列。它具有多態(tài)性高、穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，因此是一種十分理想的分子標(biāo)記，在遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）定位、標(biāo)記輔助選擇、遺傳檢測(cè)等領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用價(jià)值。第三代分子標(biāo)記是基于核酸序列開(kāi)發(fā)隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以單核苷酸多態(tài)性（SNP）為代表的第三代分子標(biāo)記迅速發(fā)展成為主流，SNP在所有生物的基因組中含量豐富，突變率較低，且獲取的成本低，因此被廣泛用于遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳和疾病相關(guān)基因的研究中。第1-3代分子標(biāo)記中幾種代表性的標(biāo)記類型的特點(diǎn)如表1所示。
表1.第1-3代標(biāo)記中幾種代表性的DNA分子標(biāo)記的特點(diǎn)
優(yōu)良的分子標(biāo)記需要具備哪些特點(diǎn)？理想的分子標(biāo)記必須滿足以下幾個(gè)要求：具有高的多態(tài)性，較高的多態(tài)水平和樣本量，有利于在試驗(yàn)中檢測(cè)出個(gè)體間的差異，差異性越大，越能體現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)基因和優(yōu)勢(shì)基因型；
共顯性遺傳，即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；
除特殊位點(diǎn)的標(biāo)記外，要求分子標(biāo)記均勻分布于整個(gè)基因組；
容易獲得且可快速分析，檢測(cè)手段便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；
開(kāi)發(fā)成本和使用成本盡量低廉；
在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性好（便于數(shù)據(jù)交換）。
SNP在基因組內(nèi)的形式有哪些，都會(huì)對(duì)生物表型有影響嗎？在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩?lái)說(shuō)，有三類：位于基因周邊的SNPs(pSNPs)，位于基因間的SNPs(iSNPs)，以及位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codingSNP，cSNP)。
位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（cSNP）比較少，但由于它發(fā)生在編碼區(qū)內(nèi)，在遺傳性疾病研究中具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。從對(duì)生物的遺傳性狀的影響上來(lái)看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP（non-synonymous cSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。
位于非編碼區(qū)域的SNP又可細(xì)分為兩類，內(nèi)含子中SNP對(duì)個(gè)基因功能的影響相對(duì)較小，主要依靠影響剪切位點(diǎn)活性來(lái)影響翻譯，從而基因功能。而基因調(diào)控區(qū)域包含啟動(dòng)子區(qū)域、增強(qiáng)子區(qū)域等等，這些區(qū)域含有很多基因表達(dá)調(diào)控元件，這些位點(diǎn)的SNP發(fā)生變化，就會(huì)導(dǎo)致與調(diào)控因子的結(jié)合能力發(fā)生改變，從而影響正常的基因表達(dá)。
由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）建立、dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)制定的 SNP 命名體系，rs 體系的 SNP 代表已獲得認(rèn)可和推薦的參考 SNP（reference SNP），ss 體系的 SNP 代表用戶新遞交但尚未得到認(rèn)可的 SNP（submitted SNP）。對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)，需要判斷這些SNP位點(diǎn)是否已知。如果該SNP位點(diǎn)是前人報(bào)道，需要查找rs號(hào)和引用參考文獻(xiàn)，如果為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)則需要將該位點(diǎn)遞交到NCBI上，獲得ss號(hào)。
SNPedia是一個(gè)SNP百科全書(shū)類網(wǎng)站，它引用已經(jīng)發(fā)布的文章或者數(shù)據(jù)庫(kù)信息，對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行描述，共享著人類基因組變異的信息。我們可以搜索某個(gè)SNP位點(diǎn)來(lái)尋找與之相關(guān)的信息，也可以根據(jù)相關(guān)疾病和癥狀來(lái)尋找相關(guān)的SNP（圖2）。
圖2.SNPedia首頁(yè)
首先尋找研究相關(guān)的 SNP 位點(diǎn)- 如果是單基因遺傳，特別是罕見(jiàn)遺傳的疾病，可以通過(guò)外顯子測(cè)序?qū)σ粋€(gè)家系的幾個(gè)個(gè)體進(jìn)行測(cè)序，篩選低頻突變，隨后找到能改變蛋白功能的突變，最后做共分離分析。
- 如果是多基因病或者質(zhì)量性狀定位，那么2個(gè)方法，一是全基因組關(guān)聯(lián)分析GWAS，用散發(fā)型個(gè)體，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，不過(guò)這種方法要的樣本量比較大，一般都要好幾百至好幾千個(gè)樣本。二是基因家系的連鎖分析，這個(gè)主要是定位，然后在后續(xù)做一些東西，一般用芯片或者全基因組重測(cè)序或者簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。
- 通過(guò)參考資料鎖定研究相關(guān)的基因，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查到基因內(nèi)部的 SNP 位點(diǎn)。
- 查找相關(guān)的參考文獻(xiàn)，找到研究相關(guān)的 SNP 位點(diǎn)。
進(jìn)行SNP位點(diǎn)驗(yàn)證，采用對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的大量樣本，驗(yàn)證目標(biāo)SNP位點(diǎn)SNaPshot 法：基于多重PCR和ABI 3730xl 測(cè)序平臺(tái)的 SNP 分型檢測(cè)；
直接測(cè)序法：基于一代測(cè)序平臺(tái)的SNP分型檢測(cè)；
質(zhì)譜法：基于Sequenom平臺(tái)的SNP分型檢測(cè)；
Taqman探針?lè)ǎ?/span>基于熒光定量PCR儀平臺(tái)的SNP分型檢測(cè)，等等。
根據(jù)已有的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的SNP分型結(jié)果與實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，如與疾病的關(guān)聯(lián)分析、遺傳連鎖分析、品種鑒定等ARMS PCR是基于Taq DNA聚合酶無(wú)法修復(fù)引物3’末端的單個(gè)堿基錯(cuò)配，從而使得擴(kuò)增受阻的檢測(cè)方法。該方法理論上單個(gè)堿基的錯(cuò)配即可阻礙PCR的擴(kuò)增，但在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，單個(gè)堿基的錯(cuò)配依然可以延伸擴(kuò)增，只是效率較低。為了提高其特異性，有時(shí)需在3’末端倒數(shù)第2位或第3位堿基處引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，該錯(cuò)配堿基與3’末端的錯(cuò)配堿基共同作用，以降低非靶標(biāo)序列的擴(kuò)增效率。而如何設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基可參考如下標(biāo)準(zhǔn)（圖3）：1）當(dāng)3’末端是“強(qiáng)”錯(cuò)配時(shí)（A/G或G/T）時(shí)，可以在引物中引入一個(gè)“弱”錯(cuò)配（C/A或C/T）；2）當(dāng)末端是“弱”錯(cuò)配時(shí)，則需要在引物中引入一個(gè)“強(qiáng)”錯(cuò)配；3）當(dāng)末端是“中”錯(cuò)配時(shí)（A/A，C/C，G/G，T/T）時(shí)，可以在引物中再引入一個(gè)“中”錯(cuò)配。一般在3’末端倒數(shù)第三個(gè)堿基引入突變，可顯著提高特異性。
雖然有以上強(qiáng)弱錯(cuò)配進(jìn)行搭配的參考原則，但在實(shí)際產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中，小編還是建議把所有堿基錯(cuò)配類型全部嘗試一遍，如引入錯(cuò)配位置模板為C堿基，則可考慮設(shè)計(jì)A/C、T/C、C/C三種錯(cuò)配進(jìn)行篩選。此外理論上，3′端倒數(shù)第2或第3位錯(cuò)配篩選到合適引物的概率最高，但假如這兩個(gè)位置效果都不理想，可嘗試3′端倒數(shù)第4、5位，甚至是倒數(shù)第7位。如果從3′端倒數(shù)第2位至倒數(shù)第7位全部篩選，總共要篩選18條引物，引物的條數(shù)是比較多的，但是確實(shí)位置不同可能效果也不同，具體什么位置無(wú)法保證，只能靠驗(yàn)證結(jié)果來(lái)決定啦。
翌圣生物作為上游原料企業(yè)，在分子酶領(lǐng)域深耕多年，目前已開(kāi)發(fā)了ARMS-PCR法及TaqMan探針?lè)ǖ腟NP分型檢測(cè)通用原料，已被下游廠家應(yīng)用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學(xué)、遺傳病檢測(cè)、疾病易感性研究等多個(gè)領(lǐng)域。
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