一，什么是報告基因？

報告基因（Reporter Gene）技術是常用于檢測轉錄因子轉錄活性，或啟動子、增強子等及其中的轉錄調控元件活性、或者5’或3’-UTR等及其中的調控元件活性的重要技術。報告基因既可以用于檢測反式作用因子(trans-element)如轉錄因子等的活性，也可以用于檢測順式作用因子(cis-element)如DNA中的轉錄因子結合位點、mRNA的3’-UTR中miRNA結合位點等的調控活性。

二，理想的報告基因須具備什么條件呢？

1.表達產物必須與細胞內源基因相區(qū)別，編碼產物的活性不受宿主細胞的干預。

2.報告基因編碼產物的檢測快速簡便、經濟、靈敏高，且重現性好、結果可靠，測量數據應該有較寬的線性范圍。

3.細胞內的其它基因產物不會干擾報告基因產物的檢測，同時報告基因的表達也不改變宿主細胞的生理功能。

常用的報告基因有：氯霉素乙酰轉移酶 （CAT），β半乳糖苷酶（β-gal或LacZ），螢光素酶（Luciferase）以及EGFP等熒光蛋白。其中螢光素酶報告基因具有檢測便捷、靈敏度高、線性范圍寬、可以進行活細胞和活體檢測等優(yōu)點，使用非常廣泛。

三，什么是螢光素酶？

螢光素酶是自然界中能夠產生生物螢光的酶的統(tǒng)稱。螢光素酶可以催化螢光素氧化成氧化螢光素，在螢光素氧化的過程中，會發(fā)出生物螢光。然后可以通過螢光測定儀(化學發(fā)光儀)測定過程中釋放的生物螢光(化學發(fā)光)。目前，最有代表性的是從螢火蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶（Renilla luciferase），還有近年來研究較多的來源于夏威夷水域的一種大型海洋橈腳類(Copepod)動物獲得的Gaussia Luciferase。

螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61kD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出波長為560nm左右的生物螢光(bioluminescence)，是目前體內外檢測實驗中的螢光素酶。在此基礎上還有用于高靈敏度檢測的快速降解型螢火蟲熒光素酶，例如pGL6-TA-CP(超靈敏快速降解型報告基因質粒) (D2094)。

海腎螢光素酶（Renilla luciferase）是一種分子量約為36kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素(Coelenterazine)氧化成Coelenteramide，反應過程無需ATP和鎂離子參與。在Coelenterazine氧化的過程中，會發(fā)出波長為480nm左右的生物螢光(bioluminescence)。

圖1. 螢光素酶的反應原理圖

四，實驗應用

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，轉錄因子與其靶啟動子中的特異性識別序列結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。借助螢光素和螢光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測熒光素酶的表達水平。從而可以用于檢測轉錄因子的活性，基因啟動子、增強子等及其調控元件的活性或者mRNA中5’或3’-UTR中的相關調控元件活性。

其具體的研究思路簡述如下：

（1）構建一個將特定啟動子或增強子，或特定待研究的調控元件插入到螢光素酶表達序列前方的報告基因質粒。進一步借助相應調控元件的突變研究，此時可以用于研究基因啟動子、增強子等及其調控元件的活性了。

（2）構建一個包含多個已知轉錄因子結合位點的報告基因質粒，例如pNFκB-TA-luc (D2207)，這樣就可以用于研究細胞中NFκB這個轉錄因子的轉錄激活水平了。

（3）構建一個包含mRNA 3’-UTR的報告基因質粒，推薦使用pGL6-miR (D2106)，把3’-UTR放在luciferase的后邊，轉錄后luciferase mRNA的穩(wěn)定性和轉錄活性就會受該3’-UTR的調控。通過3’-UTR的點突變等，就可以研究3’-UTR的調控作用以及miRNA對于該3’-UTR的調控了。

（4） 通常將上述的報告基因質粒轉染細胞。如果此轉錄因子能夠激活靶序列，則螢光素酶基因就會表達，螢光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。3’-UTR等可以調控mRNA的穩(wěn)定性和翻譯活性，最終的調控活性也和熒光素酶的活性正相關。

（5）加入特定的螢光素酶檢測試劑，螢光素酶與底物反應，產生螢光，通過檢測螢光的強度可以測定螢光素酶的活性。

圖2. 螢光素酶報告實驗圖解

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