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谷氨酸脫羧酶(GAD)測定試劑盒說明書

來源:上??ㄅ锟萍加邢薰?nbsp;  2023年10月07日 10:52  

本試劑盒僅供科研使用
 谷氨酸脫羧酶(GAD)測定試劑盒說明書
(貨號:WS2011F 分光法 24 樣) 一、產(chǎn)品簡介: 谷氨酸脫羧酶 (GAD,EC 4.1.1.15)是一種吡哆醛類裂解酶,能專一的催化 L-谷氨酸 裂解成為 γ-氨基丁酸 (GABA)CO2。GAD 廣泛分布于動植物和微生物中:哺乳動物 體內(nèi) GAD 催化產(chǎn)生的 GABA 是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì);在植物中 GAD 的活性高 低可指示種子發(fā)芽能力和出苗率等。 本試劑盒利用苯酚和次氯酸鈉比色法測定谷氨酸脫羧酶(GAD)催化產(chǎn)生的 GABA, 最終生成藍色物質(zhì),該物質(zhì)在 645nm 處有明顯光吸收,其顏色深淺與 GABA 含量呈正 比,進而得出 GAD 活力大小。 二、試劑盒組成和配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 4℃保存 臨用前甩幾下,使粉體落到底部, 再加入 6mL 試劑二溶解備用。 試劑二 液體 12mL×1 4℃保存 試劑三 液體 20mL×1 4℃保存 試劑四 液體 1.5mL×1 4℃保存 試劑五 液體 12mL×1 4℃保存 試劑六 A:液體 4.4mL×2 B:液體 5mL×1 4℃保存 臨用前2.2mL B 液進一瓶 A 中,混勻后作為試劑六使用。混勻 后的試劑半個月內(nèi)用完。 標準品 粉體 mg×1 4℃保存 若重新做標曲,則用到該標曲。 三、所需的儀器和用品: 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿(光徑 1cm)、水浴鍋、離心機、可調(diào)式移液器。 四、谷氨酸脫羧酶(GAD)活性測定: 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定,了解本批樣品情況,熟悉實驗流程,避免實驗 樣本和試劑浪費! 1、 樣本制備: ① 組織樣本:取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液,冰浴勻漿,12000rpm,4℃離心 10min, 取上清液待用。 ② 細菌/細胞樣本:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;取約 500 萬細菌或細 胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 200W,超聲 3s,間隔 10s重復(fù) 30 次);12000rpm 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。 ③ 液體樣本:直接檢測。若渾濁,離心后取上清檢測。 2、 上機檢測: ① 可見分光光度計預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 645nm,蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管依次加入: 試劑名稱(μL測定管 對照管 樣本 100 100 試劑一 200 試劑二 200 混勻,40℃孵育 30min。本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 200 200 混勻,室溫 12000rpm,離心 3min,上清液待測。 ③ 顯色反應(yīng):在 EP 管中依次加入: 上清液 200 200 試劑三 125 125 試劑四 25 25 試劑五 200 200 試劑六 200 200 混勻,20℃放置 20min,取全部澄清上清液至 1mL 璃比色皿(光徑 1cm)中,于 645nm 處讀取各管的 A 值,A=A 對照-A 測定(每個樣本需做一個自身對照)。 【注】若ΔA 值在零附近,可增加樣本質(zhì)量 W(如增至 0.2g),或延長 40℃孵育時間 T(如增 1h 或更長),或加大樣本量 V1(如增至 300μL,則試劑三相應(yīng)減少),則改變后的 W T V1 需代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算: 1、標準曲線:y = 2.0976x - 0.0059,x 為標準品摩爾質(zhì)量(μmol)y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算: 單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T×103 =397.3×(ΔA+0.0059)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算: 單位定義:每克組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T×103 =397.3×(ΔA+0.0059)÷W 4、按細胞數(shù)量計算: 單位定義:每 104個細胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T×103 =0.8×(A+0.0059) 5、按照液體體積計算: 單位定義:每毫升液體每分鐘產(chǎn)生 1nmol GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷V1÷T=397.3×(ΔA+0.0059) V---提取液體積,1mL; V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.1mL; V2---反應(yīng)體系總體積:0.5mL; V3---第②步顯色階段上清液量,0.2mL; T---反應(yīng)時間,30min; W---樣本質(zhì)量,g; 標準品 GABA 分子量---103.12500---細胞數(shù)量,萬; Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附:標準曲線制作過程: 1 標準品母液(1mg/mL):向 EP 管中加入 2mL 蒸餾水;把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品:0, 0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3 mg/mL。也可根據(jù)實際樣本來調(diào)整標準品濃度。 2 按照顯色反應(yīng)階段的測定管加樣體系操作,根據(jù)結(jié)果即可制作標準曲線。

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