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北京時間10月2日，備受矚目的“2023年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎”被授予科學(xué)家Drew Weissman和Katalin Karikó，以表彰他們在mRNA疫苗領(lǐng)域的杰出貢獻。
在新冠爆發(fā)之前，mRNA疫苗對大多數(shù)人來說還是一個相對陌生的概念。這種疫苗是通過編碼病原體某個蛋白組分的基因序列的mRNA，在體內(nèi)表達成蛋白質(zhì)進行抗原呈遞，并具有自佐劑作用。相比其他疫苗，mRNA疫苗具有“即插即用”的優(yōu)勢，只需知道病原體結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列就可以進行大規(guī)模生產(chǎn)。此外，它還能在體內(nèi)引發(fā)強烈的免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生高滴度的抗體。接下來，讓我們一起看看兩位諾獎得主在2018年發(fā)表的一篇文章[1]，以更好的理解mRNA疫苗到底有多牛！
這篇文章對mRNA疫苗的研究非常全面:
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涉及了流感疫苗、HIV疫苗和寨卡疫苗
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包含小鼠和靈長類動物實驗
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從體液應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答等方面對疫苗進行評估
m1Ψ-mRNA-LNP
可長時間有效地生產(chǎn)蛋白質(zhì)
1-甲基假尿苷（m1Ψ）修飾mRNA，可以防止mRNA疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，同時還能提高蛋白質(zhì)的表達效率。這是兩位諾貝爾獎獲得者對mRNA疫苗做出的重要改進之一。接下來，我們來看一下這種改進帶來的實驗結(jié)果：
圖1. 相對與未修飾的mRNA-LNP，編碼熒光素酶（Luc）的m1Ψ-mRNA-LNP的翻譯水平較高，并可以維持13天的蛋白質(zhì)表達
小鼠細胞免疫評估
圖2. 相比于對照mRNA、滅活流感病毒疫苗以及未修飾mRNA疫苗，m1Ψ修飾的HA mRNA疫苗（編碼流感病毒HA蛋白）能產(chǎn)生更強的抗原特異性CD4+細胞免疫應(yīng)答
對于CD8+細胞免疫應(yīng)答結(jié)果也類似。HA mRNA疫苗免疫后，總脾GC（生發(fā)中心）B細胞大幅增加（約8-59倍），單次免疫后8天脾漿細胞的數(shù)量也增加，并顯著增加了脾臟中Tfh細胞（濾泡輔助性T細胞）總數(shù)
小鼠抗體評估
流感疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度主要通過血凝抑制（HAI）測定法來測量。在這種方法種，1:40的體外HAI滴度被認(rèn)為可以保護人類免受流感感染。在接種HA mRNA疫苗單次免疫后，在2周觀察到640的HAI滴度，在4周時這個數(shù)值增加到2000。
圖3. 在體液免疫應(yīng)答方面，mRNA疫苗所產(chǎn)生的抗體滴度是最高的，并且能持續(xù)至少一年不降低
在靈長類動物實驗中，編碼寨卡病毒prM-E蛋白的mRNA疫苗，也產(chǎn)生了持續(xù)一年的高滴度抗體。
抗體親和力測定
由于Tfh細胞促進親和力成熟，小鼠單次免疫HA mRNA疫苗后多克隆抗體的親和力是重要表征模型。而高滴度不一定意味著高親和力，所以在這篇文章中，作者使用賽多利斯Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)來檢測血清中多克隆抗體的親和力！首先使用AMC傳感器（anti-mouse IgG）固化血清中的抗體，與31.25nM的HA進行結(jié)合解離，并用pH2.5的甘氨酸進行再生，然后用1:1模型擬合獲得KD值（平衡解離常數(shù)）。
在接種疫苗2周后，產(chǎn)生的抗體親和力隨著接種時間增加而增加，4周的時候KD值為362pM,8周的時候為6pM。相比之下，使用未修飾的mRNA或滅活的流感病毒顆粒免疫的小鼠中抗體的親和力低得多。Tfh細胞反應(yīng)通過體細胞超突變驅(qū)動親和力成熟；但是需要進一步對Ig可變基因進行測序，并檢測純化的單克隆抗體的親和力。
圖4. Octet® 測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)：mRNA疫苗免疫時間越長，抗體親和力越高；縱坐標(biāo)為KD值（單位nM）
圖5. 相對于未修飾的mRNA疫苗（中）和滅活疫苗（右），修飾的mRNA疫苗（左）的親和力最高
高親和力抗體的產(chǎn)生是中和多種病原體的基礎(chǔ)。這項研究證明了m1Ψ-mRNA-LNP疫苗能夠產(chǎn)生針對流感病毒、ZIKV和HIV-1的高滴度、高親和力和持續(xù)性中和抗體的能力。
輝瑞和BioNtech的
mRNA疫苗（BNT162b2）
卡里科博士作為BioNTech公司的高級副總裁，在新冠爆發(fā)后，引領(lǐng)了新冠mRNA疫苗的問世。
它是一個大規(guī)模使用的新冠mRNA疫苗。在其遞交給歐洲藥物管理局（EMA）的評估報告[2]和發(fā)表的Nature研究性文章[3]中均提到：
利用Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)（BLI技術(shù)）來測定mRNA表達產(chǎn)物的結(jié)合活性。通過生物傳感器分別固化ACE2和抗體，與293T細胞中表達的不同濃度的S蛋白（疫苗表達產(chǎn)物）進行親和力測定。兩者的親和力均在nM級別，符合正常S蛋白與受體及中和抗體的結(jié)合能力，并以此作為疫苗功能確認(rèn)的指標(biāo)之一。
在其公布臨床前研究中可發(fā)現(xiàn)，該疫苗編碼的是S蛋白，其中986/987位氨基酸殘基突變成了脯氨酸，與野生型S蛋白相比，不會與細胞膜融合，維持了融合前構(gòu)象。該疫苗的表達產(chǎn)物保持了與受體ACE2以及一種RBD中和抗體的親和力。同時，還同時設(shè)計了其他序列，一起與BNT162b2平行比較，最終選擇了BNT162b2作為候選mRNA新冠疫苗。
我們都知道，從分子生物學(xué)的角度來看，RNA是一種非常不穩(wěn)定的分子。然而，通過幾十年的技術(shù)積累，科學(xué)家們成功的將RNA做成一類疫苗，并在新冠疫情種拯救了數(shù)以千萬計的生命。這也就是為什么這次諾貝爾醫(yī)學(xué)獎眾望所歸的原因吧。
你知道嗎？連續(xù)四年的諾貝爾獎獲得者都曾使用Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)進行研究，并發(fā)表了文章：
2020-2022
好馬配好鞍，推薦兩個來自2022年諾獎得主的實驗神器！
2021諾貝爾獎得主教你用BLI技術(shù)“感知痛覺”！
2020諾獎獲得者教你做分子互作競爭實驗
使用Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)的優(yōu)勢？
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非標(biāo)記Direct Binding是趨勢，它的親和力測試結(jié)果更準(zhǔn)確
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快速測定親和力，更加定量化對互作進行表征
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無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）
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測試時間短，一般10-20分鐘，更快拿到結(jié)果
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實驗形式多樣化：定性，兩者結(jié)合，協(xié)同/競爭實驗，垂釣
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寫入了美國藥典，文章多于13,000篇，認(rèn)可度廣
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萬金油技術(shù)，可以用于檢測DNA、小分子、蛋白等各種生物分子
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使用方便，成本相對低，對粗樣品耐受性好；比如本文就直接檢測小鼠血清抗體
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通量大；本文就用Octet® 檢測了十幾個小鼠樣本（多濃度）
生物層干涉技術(shù)應(yīng)用文集
——病毒學(xué)基礎(chǔ)研究及藥物研發(fā)
下載文檔
下載《生物層干涉技術(shù)應(yīng)用文集——病毒學(xué)基礎(chǔ)研究及藥物研發(fā)》，查看更多更全面的BLI技術(shù)原理、病毒學(xué)研究及應(yīng)用展示
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