電轉(zhuǎn)百科指南①：如何提高電轉(zhuǎn)染效率？技術(shù)專家總結(jié)以下八點！

電轉(zhuǎn)百科指南②：不同細胞的電轉(zhuǎn)技巧，收藏了慢慢看！

電轉(zhuǎn)百科指南③：手把手教程來了，20種常用細胞的實驗方案

電轉(zhuǎn)百科指南④：每日問候你的細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果好嗎，支原體污染要避免

本周第五期電轉(zhuǎn)百科我們將更進一步，為大家?guī)?span style="font-synthesis: style; font-weight: 600;">CRISPR基因編輯的內(nèi)容，本章內(nèi)容將分為Knock-out與Knock-in上下篇，請繼續(xù)關(guān)注下一期的后續(xù)！

01/上篇

Knock-out

Lonza Nucleofector™核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可以廣泛應用于多種不同的場景，在不同的應用場景下通常會使用DNA或RNA或蛋白進行外源基因的遞送，以實現(xiàn)特殊的應用需求。

以CRISPR系統(tǒng)為例，全球有大量的客戶使用Lonza Nucleofector™核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)開展基于CRISPR系統(tǒng)的基因編輯相關(guān)工作并發(fā)表文章且逐年遞增。

▲ Google Scholar Search for ‘Nucleofector CRISPR’, July 2023

· 對于CRISPR的轉(zhuǎn)染，即可以通過表達Cas9的質(zhì)粒系統(tǒng)如PX458載體來實現(xiàn)“剪刀” Cas9的遞送，也可以通過Cas9 mRNA的方式在細胞質(zhì)中直接翻譯，與sgRNA形成復合物后再進入細胞核進行基因組編輯。當然我們也可以在轉(zhuǎn)染前提前將Cas9蛋白與sgRNA進行孵育形成RNP復合物，再通過電轉(zhuǎn)染遞送到細胞內(nèi)，直接進入細胞核進行基因組編輯。

· 對于CRISPR應用，主要用于knock-out或Knock-in

Knock Out：盡管Knock-out已經(jīng)比較容易實現(xiàn)高效的敲除效率，但對于陌生的細胞或者全新的位點依然需要進行適當?shù)恼{(diào)整。包括但不限于以下方面：

不同的Nucleofection條件測試

Lonza為多種常用的細胞提供預優(yōu)化的電轉(zhuǎn)程序，電轉(zhuǎn)程序與細胞相關(guān)，通常來說，即使電轉(zhuǎn)不同的核酸底物(DNA，RNA，蛋白等)無需對電轉(zhuǎn)程序進行調(diào)整，但在越來越多的原代細胞轉(zhuǎn)染中，使用RNA或RNP進行細胞基因編輯時，可以通過對程序進行適當?shù)奈⒄{(diào)，以獲得更高編輯效率的同時，更好的維持細胞的活率及功能。對于常見的T cell，HSPC，NK，DC等免疫細胞可以對Nucleofection脈沖條件進行適當調(diào)整。

▲ Akiko Seki et al., 2018

不同的crRNA/sgRNA測試

對于同一基因不同的sgRNA表現(xiàn)可能不同，目前已有大量設計sgRNA序列的工具，部分工具也可以為其打分，但通常還是建議盡可能測試多個sgRNA以確保實驗結(jié)果。甚至結(jié)合多條sgRNA對同一基因進行編輯。

▲ Akiko Seki et al., 2018

不同Cas9蛋白的測試

對于不同供應商的Cas9蛋白也存在切割活性的差異，對于WT Cas9和一些經(jīng)過優(yōu)化的Cas9蛋白也會導致編輯效率的差異。

▲ Akiko Seki et al., 2018

▲ Liyang Zhang et al., 2021

Cas9用量測試

除對不同Cas9蛋白來源的測試外，Cas9的用量也是需要在試驗優(yōu)化中考量的因素。

▲ Liyang Zhang et al., 2021

Cas9:sgRNA比例測試

對于Cas9蛋白和sgRNA形成的蛋白復合物，以何種比例添加進行孵育轉(zhuǎn)染必定也是重要的因素。在大多數(shù)的出版物中，Cas9:gRNA的比值在1:1.2 - 1:5之間。

▲ Akiko Seki et al., 2018

Electroporation Enhancer

有時可以考慮使用electroporation enhancer以實現(xiàn)更高的編輯效率。

▲ Matteo Martufi et al., 2019

市面上大多數(shù)提供Cas蛋白或sgRNA的供應商通常也會提供一份詳細的protocol，可以優(yōu)先參考這些protocol或相關(guān)的paper。除上面提到的方向外，供體差異，轉(zhuǎn)染的時間點，對于免疫細胞(如T細胞)，何種激活劑激活也可能會對最終的結(jié)果造成影響。